Shh信號通路參與慢性粒細胞白血病干-祖細胞調(diào)控的研究.pdf

1、本文內(nèi)容主要分為四部分：
　　第一部分
　　Shh信號通路在慢性粒細胞白血病的表達及與疾病進展的相關(guān)性
　　目的：本研究旨在探討 Shh信號通路關(guān)鍵組分在慢性粒細胞白血病患者和健康對照的骨髓單個核細胞的表達差異,以明確 Shh信號通路在慢性粒細胞白血病的活化狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上,進一步分析 Shh信號通路在慢性粒細胞白血病慢性期、加速期、急變期活化狀態(tài)的差異,以明確 Shh信號通路與慢性粒細胞白血病疾病進展的相關(guān)性。

2、>　　方法：收集我院初診的慢性期、加速期、急變期的慢性粒細胞白血病患者及健康對照的骨髓標本,分離骨髓單個核細胞。用普通 PCR方法(RT-PCR)檢測 Shh信號通路的關(guān)鍵組分 SHH、SMO、PTCH1、GLI1基因在慢性粒細胞白血病患者及健康對照的骨髓單個核細胞的表達差異,并采用更為敏感的Real time PCR(RQ-PCR)技術(shù)進一步檢測慢性粒細胞白血病各期標本之間及與健康對照之間的SHH、SMO、PTCH1、GLI1基因的表

3、達差異。
　　結(jié)果：Shh信號通路的每一個組分在同一期慢性粒細胞白血病患者不同個體之間存在著差異表達,以慢性期最為顯著。大約50％的慢性期標本,70％的加速期標本和80％的急變期標本骨髓單個核細胞 Shh信號通路的正向調(diào)控組分 SHH、SMO、GLI1基因的表達較正常健康對照升高2倍以上,表明慢性粒細胞白血病骨髓單個核細胞存在著Shh信號通路的活化。與慢性期相比,加速期和急變期的患者出現(xiàn) Shh信號通路活化的比例和程度明顯增高,表

4、明 Shh信號通路與慢性粒細胞白血病的疾病進展正相關(guān)。
　　結(jié)論：慢性粒細胞白血病骨髓單個核細胞存在著 Shh信號通路的活化,Shh信號通路與慢性粒細胞白血病的疾病進展相關(guān)。
　　第二部分
　　Shh信號通路在慢性粒細胞白血病干/祖細胞的表達
　　目的：本研究旨在探討 Shh信號通路的關(guān)鍵組分在慢性粒細胞白血病干/祖細胞的表達,以明確 Shh信號通路在慢性粒細胞白血病干/祖細胞的活化狀態(tài)。
　　方法：收集我

5、院初診的慢性期、加速期、急變期的慢性粒細胞白血病骨髓標本,流式細胞術(shù)檢測各期 CD34的陽性率。免疫熒光法檢測 CD34/C-kit與 Shh蛋白在加速期和急變期骨髓涂片的共表達。陽性免疫磁珠分選法分離骨髓 CD34+細胞。流式細胞術(shù)檢測磁珠分選的效率。用實時定量 PCR方法檢測 Shh信號通路的關(guān)鍵組分 SHH、SMO、PTCH1、GLI1在 CD34+細胞與 CD34-細胞的表達。用免疫熒光法檢測 Shh蛋白在 CD34+細胞與 C

6、D34-細胞的表達。分離骨髓基質(zhì)細胞,免疫熒光法檢測 Shh蛋白在骨髓基質(zhì)細胞的表達。用普通 PCR的方法檢測 Shh信號通路的關(guān)鍵組分 SHH、SMO、PTCH1、GLI1在慢性粒細胞白血病細胞系 K562的表達,免疫熒光法檢測 Shh蛋白在 K562細胞的表達。
　　結(jié)果：CML-CP、CML-AP、CML-BP標本的CD34+細胞分別在0.2％～2.0％、4.0％～10.0％、12.5％～97.5％范圍內(nèi)。CD34和Shh蛋

7、白以及c-kit和Shh蛋白在加速期和急變期的骨髓涂片中呈現(xiàn)一致性表達,即高表達 CD34或 c-kit的細胞同時高表達 Shh蛋白,而低表達 CD34或 c-kit的細胞同時低表達 Shh蛋白。磁珠分選的CD34+細胞的在95％以上。純化的CD34+細胞與 CD34-細胞相比,高表達 Shh信號通路的正向調(diào)控組分 SHH、SMO、GLI1,而低表達 Shh信號通路的負向調(diào)控組分 PTCH1。CD34+和CD34-細胞內(nèi)也可見 CD34

8、與 Shh蛋白的一致性表達。慢性粒細胞白血病骨髓基質(zhì)細胞低表達 Shh蛋白。K562細胞表達 Shh信號通路的關(guān)鍵組分,Shh蛋白在 K562細胞內(nèi)呈現(xiàn)差異表達:部分細胞高表達 Shh蛋白,其余細胞低表達 Shh蛋白。
　　結(jié)論：慢性粒細胞白血病干/祖細胞內(nèi)存在著 Shh信號通路的活化,自我分泌的Shh蛋白介導(dǎo)了慢性粒細胞白血病干/祖細胞內(nèi) Shh信號通路的自我激活。
　　第三部分
　　Shh信號通路對慢性粒細胞白血病

9、干/祖細胞功能的影響
　　目的：本研究旨在探討 Shh信號通路對慢性粒細胞白血病干/祖細胞生存和增殖的影響。
　　方法：磁珠分選性慢粒細胞白血病加速期、急變期的骨髓 CD34+和CD34-的細胞,純化的CD34+和CD34-的細胞于10ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6、50ng/ml SCF培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。CD34+和CD34-的細胞均分別用外源性 Shh肽和Shh通路的抑制劑cyclopamine作用72h,

10、MTT法檢測細胞增殖。K562細胞進行以下分組⑴對照組⑵Shh組(500ng/ml)⑶ cyclopamine組(10μM)⑷ Shh(500ng/ml)+cyclopamine(10μM)組,24、48h后收獲細胞,MTT法檢測細胞增殖。Shh信號通路的抑制劑5E1單克隆抗體(4、6、8、10、20、30μg/ml)和cyclopamine(10、20、40μM)分別作用于 K562細胞,24h后采用普通光學(xué)顯微鏡觀察細胞數(shù)目的變化,

11、 Annexin V/PI法檢測細胞的凋亡率,PI法檢測細胞周期。體外化學(xué)合成針對 GLI1的小干擾 RNA(siRNA),通過脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)介導(dǎo)將其導(dǎo)入 K562細胞,并以非特異性的siRNA轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。設(shè)置 siRNA濃度梯度(40、60、80、100、200 pmol),檢測轉(zhuǎn)染效率,探索最佳轉(zhuǎn)染濃度。實時定量 PCR和western blot法檢測 siRNA的沉默效應(yīng)。MTT法檢測轉(zhuǎn)染后2

12、4、48h細胞的增殖能力。
　　結(jié)果：純化的CD34-細胞在外源性 Shh肽的作用下,經(jīng)過72h細胞擴增了1.18±0.04倍,純化的CD34+細胞擴增了1.64±0.11倍,CD34+細胞的擴增幅度明顯高于 CD34-細胞(P<0.01)。純化的CD34-細胞在外源性 cyclopamine作用下,經(jīng)過72h,細胞數(shù)目為最初的0.75±0.03倍,而CD34+細胞為最初的0.88±0.04倍,CD34+細胞的凋亡幅度明顯低于 C

13、D34-細胞(P<0.01)。經(jīng)過24h,對照組的K562細胞數(shù)目是最初的1.57±0.09倍,Shh組是最初的1.63±0.10倍(與對照組相比,P=0.13),cyclopamine組是最初的1.05±0.08倍(P<0.01),Shh+cyclopamine組是最初的1.17±0.09倍(P<0.01),經(jīng)過48h,對照組的K562細胞數(shù)目是最初的1.32±0.08倍,Shh組是最初的1.78±0.07倍(與對照組相比,P<0.0

14、1),cyclopamine組是最初的0.64±0.07倍(P<0.01), Shh+cyclopamine組是最初的0.72±0.10倍(P<0.01)。表明外源性 Shh肽促進了K562細胞的增殖,而cyclopamine誘導(dǎo)了K562細胞凋亡,并呈現(xiàn)時間依賴性。5E1單克隆抗體和cyclopameine以劑量依賴的方式誘導(dǎo)了K562細胞的凋亡,并誘導(dǎo)了K562細胞 G2/M期阻滯。轉(zhuǎn)染后24h,實驗組 GLI1mRNA表達水平為對

15、照組的(52.60±3.57)％(P<0.01),48h為對照組的(88.83±5.21)％( P=0.01),72h為對照組的1.36±0.11倍(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后24h實驗組 Gli1的蛋白表達水平為對照組的(88.60±6.13)％(P=0.02),48h為對照組的(79.31±5.58)％(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后24h實驗組細胞數(shù)目為對照組的(94.41±3.58)％( P=0.05),48h為對照組(90.22±3.34

16、)％( P<0.01),表明 GLI1 siRNA抑制了GLI1的表達,并誘導(dǎo)了細胞凋亡。
　　結(jié)論：自我激活的Shh信號通路維持了慢性粒細胞白血病干/祖細胞的生存,并促進了其增殖,靶向抑制Shh信號通路可以導(dǎo)致慢性粒細胞白血病干/祖細胞的凋亡和細胞周期阻滯。
　　第四部分
　　Shh信號通路調(diào)控慢性粒細胞白血病干/祖細胞的機制
　　目的：本研究旨在通過研究慢性粒細胞白血病干/祖細胞內(nèi) Shh信號通路與 Wnt信

17、號通路的關(guān)系及相互作用以明確 Shh信號通路調(diào)控 CML干/祖細胞的機制。
　　方法：磁珠分選慢性粒細胞白血病加速期、急變期的骨髓標本的CD34+和CD34-的細胞。免疫熒光法檢測 Shh蛋白和β-catenin蛋白在 CD34+和CD34-的細胞表達。分離骨髓基質(zhì)細胞,免疫熒光法檢測 Shh蛋白和β-catenin蛋白在骨髓基質(zhì)細胞的表達。RT-PCR檢測 Shh信號通路的關(guān)鍵組分和Wnt信號通路的關(guān)鍵組分在 K562細胞的表達

18、,免疫熒光法檢測 Shh蛋白和β-catenin蛋白的表達。將 K562細胞進行如下分組(1)對照組(2)Shh抗體組(10μg/ml)(3)Shh抗體(10μg/ml)+ Wnt3a(500ng/ml)組(4)Wnt3a抗體(10μg/ml)(5)Wnt3a抗體(10μg/ml)+ Shh-N(500ng/ml)組, Annexin V/PI檢測各組的凋亡率。RT-PCR檢測 K562細胞在10μg/ml Shh抗體作用24h后 GL

19、I1、β-CATENIN、C-MYC的表達變化。Real time PCR檢測 K562細胞分別在10μg/ml Shh抗體作用24h后 GLI1、β-CATENIN、C-MYC、、P21、BCL-2的表達變化。
　　結(jié)果：CD34+及CD34-的細胞、骨髓基質(zhì)細胞、K562細胞內(nèi)均呈現(xiàn) Shh蛋白和β-catenin蛋白的共表達。K562細胞表達 Shh信號通路和Wnt信號通路關(guān)鍵組分。K562細胞對照組24h后的凋亡率是4.1

20、5±1.02％,Shh抗體組(10μg/ml)的凋亡率是15.88±2.87％,Shh抗體(10μg/ml)+ Wnt3a(500ng/ml)組的凋亡率是8.41±1.38％(與Shh抗體組相比 P<0.01), Wnt3a抗體(10μg/ml)的凋亡率是17.34±3.15％,Wnt3a抗體(10μg/ml)+ Shh-N(500ng/ml)組凋亡率是14.89±2.79％(與 Wnt3a抗體組相比, P=0.60)。即 Wnt3a能

21、部分逆轉(zhuǎn) Shh抗體誘導(dǎo)的細胞凋亡,而Shh-N不能逆轉(zhuǎn) Wnt3a抗體誘導(dǎo)的細胞凋亡,表明 Wnt信號通路位于 Shh信號通路的下游。K562細胞在10μg/ml Shh抗體作用24 h后 GLI1的表達下降了7.92±0.89倍,β-CATENIN的表達下降了0.21±0.14倍,C-MYC的表達下降了4.95±0.57倍,P21的表達上調(diào)了11.57±1.23倍,BCL-2的表達下調(diào)了2.55±0.21倍。GLI1、C-MYC、B