5-Aza-dC及TSA對(duì)胃癌細(xì)胞系中P16和hMLH-1基因甲基化水平及表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 近來(lái)，在腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)高甲基化異常是導(dǎo)致許多腫瘤抑制基因表達(dá)異常的內(nèi)在機(jī)制，癌基因的激活和抑癌基因的失活為其中兩個(gè)重要的分子事件。目前，普遍認(rèn)為DNA甲基化除缺失與突變之外導(dǎo)致基因失活的第三種機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著不可忽視的作用。由于高甲基化而不表達(dá)的抑癌基因，如果能應(yīng)用去甲基化制劑逆轉(zhuǎn)甲基化異常狀態(tài)，使之重新表達(dá)，理論上即可發(fā)揮起抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能。 胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)局各類惡

2、性腫瘤之首。近年來(lái)，早期胃癌術(shù)后5年生存率已有很大提高，但進(jìn)展期胃癌術(shù)后5年生存率一直沒有進(jìn)一步提高。研究表明，胃癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多階段的過程。 本實(shí)驗(yàn)采用甲基化特異性PCR(MSP)及反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法探討5-Aza-dC及TSA對(duì)胃癌細(xì)胞系中抑癌基因P16和hMLH-1基因甲基化水平和基因表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)為闡明細(xì)胞增殖、分化、癌變過程提供線索，并且可能為腫瘤的臨床診斷、治療、預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 方法： 1、胃癌細(xì)胞系培養(yǎng)及5-Aza-dC、TSA干預(yù)：細(xì)胞接種于含10 mL/L小牛血清(56℃滅活30 min)、100×103U/L青霉素及100×103U/L鏈霉素的pH7.2的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、含5％CO2的濕潤(rùn)空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分成四組，分別應(yīng)用5-Aza-dC及TSA干預(yù)。(1)加5μmol/L 5-aza-dC培養(yǎng)72小時(shí)；(2)加TSA300nmol/L培養(yǎng)24小時(shí)；(3)

4、加5μmol/L 5-Aza-dC培養(yǎng)48小時(shí)后加TSA300nmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。 2、標(biāo)本的抽提：采用酚/氯仿法抽提基因組DNA，用TRIZOL試劑提取總RNA。 3、甲基化特異性PCR：先用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，純化DNA后使用P16、hMLH-1基因甲基化及非甲基化引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。 4、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)：先將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以P16、hMLH-1基因引物進(jìn)行PCR

5、擴(kuò)增，同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參。 5、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，采用FluorChen V.2.0軟件，對(duì)圖像中的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行光密度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 結(jié)果： 1、胃癌細(xì)胞系MKN-45和MGC-803均顯示P16、hMLH-1基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化，其中P16基因在兩種胃癌細(xì)胞系中均表現(xiàn)為甲基化，hMLH-1基因在胃癌細(xì)胞系MGC-803中表現(xiàn)為甲基化而在胃癌細(xì)胞系MKN-45中

6、表現(xiàn)為半甲基化。 2、MKN-45和MGC-803細(xì)胞系經(jīng)TSA，5-Aza-dC及聯(lián)合作用后使原來(lái)不表達(dá)或有弱表達(dá)的抑癌基因P16和hMLH-1重新表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)。 3、在5-Aza-dC及TSA的作用下，MKN-45和MGC-803細(xì)胞系中P16及hMLH-1基因的甲基化狀態(tài)得到了逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論： P16及hMLH-1基因的異常甲基化是胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的頻繁事件。胃癌細(xì)胞系中抑癌基因P16和hMLH