柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病是一種以高血糖和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)改變?yōu)樘卣鞯?涉及葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂的綜合癥,可導(dǎo)致血管損傷以及器官功能失調(diào)。糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥,常見于心、腦、腎及視網(wǎng)膜,它是糖尿病病人致殘、致死的主要因?yàn)橹?因此,國內(nèi)、外學(xué)者十分關(guān)注糖尿病血管病變的機(jī)制研究以及尋找有效治療藥物。
　　 糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生主要由5條通路異常所致:包括多元醇通路代謝亢進(jìn)；蛋白質(zhì)糖基化及其終末產(chǎn)物(AGE)形成增加；蛋白

2、激酶C(PKC)激活；己糖胺通路活性增高；核因子Kappa-B(nuclear factor-kappa B,NF-κ B)的激活。在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制中,活性氧(ROS)的增加扮演中心角色。酶、非酶及線粒體等因素影響ROS的產(chǎn)生。例如:NADPH氧化酶,黃嘌呤氧化酶,環(huán)氧合酶,細(xì)胞色素P450依賴性氧化酶,內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS),線粒體電子傳遞鏈,AGEs,PKC,活化的多元醇以及氨基已糖等一系列生化物質(zhì)都可以

3、導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生。其中,線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生在糖尿病代謝綜合征中起到關(guān)鍵作用。線粒體內(nèi)的過量ROS刺激多個生理反應(yīng),如活化PKC,合成生長因子及細(xì)胞因子,激活NF-kB和NAPDH氧化酶等。
　　 一氧化氮是一種新型生物信使分子,分布于生物體內(nèi)各組織中,具有廣泛的生物學(xué)活性,其生成依賴于一氧化氮合酶。一氧化氮合酶有三個亞型,包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)

4、、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitricoxide synthase,nNOS)。eNOS是鈣依賴蛋白酶,存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞,在生理狀態(tài)下,被上游信號分子磷酸化,然后催化精氨酸合成NO,維持血管的生理功能,如血管張力和括約肌松弛等。eNOS是內(nèi)皮功能完整的標(biāo)志之一,正常情況下,eNOS合成NO,起保持內(nèi)皮光滑完整,防止血栓形成的作

5、用。
　　 柚皮昔全稱為柚皮素-7-o-新橙皮糖苷,屬二氫黃酮類化合物,是橘紅、骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼等中藥的主要有效成分,具有廣泛的生物學(xué)活性:包括抗氧化、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化等生物學(xué)活性。柚皮苷可能對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附具有抑制作用。基于上述背景,本研究擬建立高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附模型,觀察柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附作用的影響,并探討可能的作用機(jī)制。
　　 研究的主要方法和

6、結(jié)果如下:
　　 一、柚皮苷抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附33mmol/L的高糖誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞48小時,然后采用熒光標(biāo)記的單核細(xì)胞與誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞共孵育3小時,建立粘附模型。然后用此模型來評價柚皮苷對內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的抑制作用。熒光顯微鏡下觀察到,對照組:11mmol/L的糖培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時,少量單核THP-1細(xì)胞粘附于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；高糖組:33mmol/L的高糖誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時

7、,粘附于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的THP-1細(xì)胞明顯增加；同時采用熒光分光光度計(jì)檢測結(jié)果表明,33mmol/L的高糖處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時,明顯誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附。本研究成功建立了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附模型。并首次發(fā)現(xiàn),10、25、50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2小時明顯抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核THP-1細(xì)胞的粘附。
　　 二、柚皮苷抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子和粘附分子的表達(dá)
　　

8、 本研究采用ELISA方法研究了柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子和粘附分子分泌和表面表達(dá)的影響。結(jié)果表明33mmol/L的高糖處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時明顯誘導(dǎo)核細(xì)胞趨化蛋白-1的分泌,及P-選擇素、E-選擇素、粘附分子-1和細(xì)胞間粘附分子-1的表面表達(dá),與文獻(xiàn)報道的一致。然而10、25、50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2小時明顯抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核細(xì)胞趨化蛋白-1的分泌,及P-選擇素、E-選擇素、粘附分子-

9、1和細(xì)胞間粘附分子的表面表達(dá)。我們進(jìn)一步采用Western blot技術(shù)研究柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞粘附分子-1 和細(xì)胞間粘附分子的蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明10、25、50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2小時明顯抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞粘附分子-1 和細(xì)胞間粘附分子的蛋白表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)柚皮苷在整個細(xì)胞水平抑制粘附分子的表達(dá)。然后我們采用實(shí)時定量RT-PCT技術(shù)研究了柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞粘附分

10、子-1 和細(xì)胞間粘附分子mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10、25、50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2小時明顯抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞粘附分子-1 和細(xì)胞間粘附分子mRNA的表達(dá)。
　　 三、柚皮苷抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生
　　 本研究采用熒光探針進(jìn)行活性氧檢測,研究柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明10、25、50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞4小時明顯抑制高

11、糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。
　　 四、柚皮苷抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κ B信號通路的活化我們采用Western blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)研究了柚皮苷對核因子-kappa B信號通路的活化的影響。與對照組比較,33mmol/L的高糖處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時明顯增加了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核NF-κ B p65的量； 10～50 μ g/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞1小時,與高糖組比較,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核NF-κ

12、B p65的量明顯減少。實(shí)驗(yàn)表明在高糖的刺激下NF-κ B p65由胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)增加,然而柚皮苷明顯抑制了NF-κ B p65由胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。與對照組比較,33mmol/L的高糖處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時明顯減少了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿Ⅰ-κ B的量； 10～50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞4小時,與高糖組比較,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿Ⅰ-κ B的量明顯增加。實(shí)驗(yàn)表明在高糖的刺激下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿Ⅰ-κ B降解增加,然而柚

13、皮苷明顯抑制了胞漿Ⅰ-κ B降解。接下來我們采用細(xì)胞免疫方法用熒光顯微鏡觀察NF-κ B p65由胞漿向胞核的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)一步證實(shí)柚皮苷抑制了NF-κ B p65由胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。與對照組比較,在高糖處理組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核紅色熒光明顯增強(qiáng),表明高糖增加了NF-κ B p65由胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。25 μg/ml柚皮昔預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞4小時明顯減少NF-κ B p65由胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 五、柚皮苷逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈

14、內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化eNOS的減少及NO產(chǎn)生的減少
　　 采用熒光探針進(jìn)行一氧化氮產(chǎn)生的檢測,研究柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明10、25、50μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2小時明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生。采用Western blot技術(shù)檢測磷酸化eNOS的表達(dá),結(jié)果表明10、25、50 μg/ml柚皮苷預(yù)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2小時明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化eNOS的

15、表達(dá),表明柚皮苷可能通過影響一氧化氮的產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　 六、高糖及柚皮苷對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
　　 5～100 μg/ml劑量范圍內(nèi)的柚皮苷處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24、48和72 h后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長均受不受影響。說明抑制粘附的作用不是由于柚皮苷的細(xì)胞毒作用導(dǎo)致的。不同濃度葡萄糖:5.5、11、33、50mmol/L處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24和48 h后,細(xì)胞的生長均受不受影響,表明33mmol/

16、L葡萄糖培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48h不影響細(xì)胞增殖。
　　 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究的結(jié)論如下:
　　 一、柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核THP-1細(xì)胞的粘附具有明顯
　　 的抑制作用。
　　 二、柚皮苷明顯抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核細(xì)胞趨化蛋白-1、P-選擇素、E-選擇素、粘附分子-1和細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)。
　　 三、柚皮苷明顯抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生。
　　

17、 四、柚皮苷抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κ B信號通路的活化。
　　 五、柚皮苷明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化eNOS的減少及一氧化氮產(chǎn)生的減少。
　　 綜上所述,柚皮苷通過抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生,從而抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κ B信號通路的活化,抑制粘附分子在基因和蛋白水平的表達(dá),進(jìn)一步抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,發(fā)揮抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用。柚皮苷通過逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的臍