豬GSK3β蛋白對(duì)Il-10、Il-12和GYS1基因表達(dá)的調(diào)控研究.pdf

1、糖原合成酶激酶3(GSK3)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的絲氨酸/蘇氨酸類激酶，其作用的底物高達(dá)100多種，參與眾多的信號(hào)通路并在其中發(fā)揮重要的功能。在哺乳動(dòng)物中GSK3存在GSK3α和GSK3β兩種亞型，它們雖然在結(jié)構(gòu)上具有非常高的同源性，但是其功能卻是不盡相同的。本研究目的在于探究豬GSK3β蛋白及其不同亞型在炎癥反應(yīng)的作用以及對(duì)其直接作用底物糖原合成酶(GS)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，為進(jìn)一步研究GSK3β基因在豬的抗病育種以及肌肉糖原代謝中

2、的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　(1)用LPS誘導(dǎo)豬腎細(xì)胞系(PK-15)，使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，或用GSK3β抑制劑LiCl處理細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)GSK3β的磷酸化程度，進(jìn)而檢測(cè)其活性變化。結(jié)果表明:LPS處理、LiCl處理以及LiCl/LPS共同處理能通過升高PK-15細(xì)胞中的GSK3β(ser9)的磷酸化程度從而降低其GSK3β蛋白的活性;
　　(2)利用ELISA技術(shù)檢測(cè)LPS刺激細(xì)胞以

3、及先用LiCl處理再用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12含量。結(jié)果表明:LPS處理極顯著增加細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12量（P＜0.01);而使用GSK3β活性抑制劑即LiCl預(yù)先處理細(xì)胞后再用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞組的IL-10和IL-12表達(dá)量較空白組有顯著的增加(P＜0.05），但較LPS處理組又有顯著的降低(P＜0.05)，表明GSK3β參與了由LPS誘導(dǎo)的PK-15細(xì)胞對(duì)IL-10和IL-12的分泌;

4、
　　(3)利用qPCR檢測(cè)LPS誘導(dǎo)后GSK3β的5種亞型的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS處理細(xì)胞能引起GSK3β基因5種亞型mRNA表達(dá)水平的變化。其中GSK3β2在15，30，60和120 min呈現(xiàn)顯著地下降(P＜0.01); GSK3β5在30，60和120 min呈現(xiàn)顯著地下降(P＜0.05); GSK3β3在15，30 min有一個(gè)短暫的顯著上升(P＜0.05)。這個(gè)結(jié)果說明，GSK3β基因5種亞型可能對(duì)由LP

5、S誘導(dǎo)細(xì)胞的IL-10和IL-12分泌具有不同的調(diào)節(jié)作用;
　　(4)表達(dá)GSK3β的4種亞型后，用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞并用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12量均出現(xiàn)顯著增加(P＜0.05）。其中GSK3β1的促進(jìn)作用最為強(qiáng)烈，GSK3β3次之，GSK3β2和GSK3β5相對(duì)最弱;
　　(5)利用qPCR檢測(cè)不同時(shí)間的IGF-1處理下的GYS1和GYS2基

6、因的表達(dá)模式。在外源添加物胰島素樣生長因子(IGF-1)的刺激下，GYS1的mRNA水平表達(dá)出現(xiàn)顯著的上調(diào)變化而GYS2的mRNA水平的表達(dá)量沒有顯著變化;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中過表達(dá)GSK3β后，GYS1的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)極顯著的下降，說明GSK3β影響GYS1的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá);
　　(6)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)構(gòu)建的GYS1的啟動(dòng)子片段活性以及GSK3β共轉(zhuǎn)染GYS1的5個(gè)啟動(dòng)子片段后的其啟動(dòng)子的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其5個(gè)啟動(dòng)子

7、片段單獨(dú)轉(zhuǎn)染后的相對(duì)熒光值較pGL3-basic有顯著的提高(P＜0.05)，其中片段+224/-350的活性顯著高于+224-/147片段和+224-/539片段(P＜0.05);而GSK3β與GYS1的5個(gè)啟動(dòng)子片段共轉(zhuǎn)染后，pGL3-350/+224，pGL3-961/+224，pGL3-1488/+224這三個(gè)片段的啟動(dòng)子相對(duì)熒光值顯著降低(P＜0.05)，說明在GYS1基因的-147至-350，-350到-539以及-539至