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文檔簡介
1、本實驗將本地沼澤型成年水牛外周血單核細胞(Peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)在刀豆素A(Concanavalin A,ConA)的刺激下體外培養(yǎng),提取培養(yǎng)的單核細胞總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)擴增水牛白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白細胞介素-5(interleukin-5,IL-5)、白
2、細胞介素-10(interleukin-10.IL-10)、白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α),并克隆到pMD18-T載體上,然后進行測序。 序列分析顯示,克隆的IL-2 cDNA長724bp.包括一個全長為468bp的完整編碼區(qū)(ORF).共編碼155個
3、氨基酸,分子量為17.5KDa。在核苷酸水平上與印度水牛、牛、綿羊、山羊、豬、狗、人和鼠的IL-2基因同源性為99.6%、98.5%、98.3%、97.4%、85.6%、78.4%、80.3%、65.2%;推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為98.7%、96.8%、96.2%、94.2%、72.9%、61.5%、64.9%、48.7%。 克隆的IL-4 cDNA長469bp,包括一個全長為408bp的完整編碼區(qū)(ORF),共編碼135個氨基
4、酸,分子量為15.0KDa。在核苷酸水平上與印度河流型水牛、牛、綿羊、豬、馬、鼠和人的IL-4 cDNA同源性分別為98.8%、99.3%、94.1%、84.8%、80.6%、62.7%和75.2%;推導(dǎo)的氨基酸的同源性分別為96.3%、98.5%、90.4%、78.4%59.6%、39.0%和64.7%。 克隆的IL-5 cDNA序列,長430bp,ORF為405bp,共編碼134個氨基酸,分子量為15.3KDa。經(jīng)與GenB
5、ank中牛、綿羊、豬和馬的IL-5 cDNA序列比較可知,所克隆的基因與它們的同源性分別為99.0%、96.5%、89.6%和89.1%。氨基酸的同源性分別為97.8%、96.2%、85.9%和86.7%。 克隆的水牛IL-10的完整編碼區(qū)cDNA序列,經(jīng)分析其開放閱讀框架(ORF)長為536bp,編碼178個氨基酸,分子量為22.4KDa。與GenBank中印度河流型水牛、牛、羊、豬、馬、人和鼠的IL-10 cDNA序列比較可
6、知,所克隆的IL-10基因與它們的同源性為99.6%、97.2%、93.6%、83.9%、89.0%、85.1%和75.8%。氨基酸的同源性為100%、93.3%、89.3%、79.5%、88.2%、80.9%和74.2%。 克隆的水牛IL-12 p35基因序列全長694bp,含一個全長為666bp的完整開放閱讀框(ORF),編碼222個氨基酸,推測其分子質(zhì)量為24.86kDa。與GenBank登錄的印度河流型水牛p35的核苷酸
7、同源性為99.7%,氨基酸同源性為98.6%,與牛、羊、豬、馬、人和鼠的核苷酸同源性為98.5%、97.7%、77.6%、85.3%、85.3%和70.0%,氨基酸同源性為97.3%、95.5%、68.5%、79.7%、81.1%和55.9%??寺〉乃L-12 p40基因序列全長1013bp,含一個全長為984bp的完整開放閱讀框(ORF),編碼328個氨基酸,推測其分子質(zhì)量為37.03 kDa。與GenBank登錄的印度河流型水牛
8、p40的核苷酸同源性為99.5%,氨基酸同源性為98.8%,與牛、羊、豬、人和鼠的核苷酸同源性為98.6%、97.4%、81.1%、87.7%和74.9%,氨基酸同源性為97.6%、96.0%、75.6%、83.8%和67.7%。 克隆的水牛IL-18基因序列全長602bp,含一個全長為582bp的完整開放閱讀框(ORF),編碼193個氨基酸,推測其分子質(zhì)量為22.18kDa。與GenBank登錄的印度河流型水牛IL-18的核苷
9、酸同源性為99.1%,氨基酸同源性為99.0%,與牛、綿羊、山羊、豬、馬、人和鼠的核苷酸同源性為99.3%、97.8%、97.1%、91.5%、91.6%、85.6%和67.7%,氨基酸同源性為98.5%、94.8%、94.3%、89.1%、、87.1%、77.8%和60.6%。 克隆的水牛TNF-α基因序列全長715bp,含一個全長為705bp的完整開放閱讀框(ORF),編碼234個氨基酸,推測其分子質(zhì)量為25.56kDa。與
10、GenBank登錄的印度河流型水牛TNF-α的核苷酸同源性為99.7%,氨基酸同源性為98.7%,與牛、綿羊、山羊、豬、人的核苷酸同源性為98.6%、95.6%、96.2%、84.0%和73.0%,氨基酸同源性為97.9%、91.5%、91.9%、80.7%和70.6%。 這些結(jié)果表明本實驗成功克隆出水牛的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(p35、p40)、IL-18和TNF-α基因,為今后研究和利用水牛細胞
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