α-干擾素聯合化療藥物對肝癌細胞凋亡信號傳導通路的干預作用及其機制.pdf

1、肝癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，國際抗癌研究中心(IARC)估計每年全球肝癌新發(fā)病例約56.4萬，肝癌死亡病例約54.9萬，其中中國肝癌新發(fā)病例30.6萬，死亡病例30.0萬。由此可見，中國的肝癌發(fā)病(死亡)數就占了全球所有肝癌病例的一半還要多。肝癌在我國發(fā)病率為癌癥中第三位(肺、胃、肝)，其死亡率為第二位(肺、肝、胃)，在各種腫瘤中它的惡性程度很高，對健康的危害是很大的。肝癌的治療在早期多以手術治療輔助放化療，中晚期的肝癌主要以放化

2、療為主，目前臨床的化療方案多是聯合化療，存在副作用大及耐藥增多等現象。IFN-α聯合5-FU最早被應用于結腸癌的治療，并取得了一定的效果。后來這種聯合治療方法被應用于食道癌和胃癌等，均取得了滿意的效果。關于IFN-α聯合5-FU作用機制的研究報道較少，研究前景廣闊。 干擾素(interferon，IFN)是細胞對相關刺激反應時所產生的細胞信號蛋白質，是細胞因子超家族中一個糖蛋白類同源細胞因子家族，稱為IFN家族。目前已鑒定出該家

3、族中的3個主要成員：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN-α由白細胞和原始淋巴細胞分泌，現已通過基因重組技術生產，并被廣泛應用于治療白血病、淋巴瘤、實體瘤及病毒、原蟲、寄生蟲和真菌感染，其治療策略包括使用IFN-α單一治療、輔助治療和維持治療。近期研究表明，IFN-α與其受體結合后，可激活多種信號轉導途徑，影響腫瘤細胞凋亡信號傳導通路，從而發(fā)揮其抗腫瘤、抗增殖及免疫調節(jié)的生物學功能。 5-FU屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺

4、嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換成胸腺嘧啶核苷酸，干擾DNA的合成，對RNA的合成也有一定的抑制作用，是惡性腫瘤化學治療的常用藥物。最近的研究發(fā)現，5-FU對腫瘤細胞凋亡信號傳導也有影響。主要涉及到Fas/FasL、NF-кB和caspase-8、Bcl-2家族、線粒體膜電位等的變化。但在不同細胞系間存在差異，且體外研究發(fā)現單獨應用5-FU時，效應劑量較大，細胞毒作用明顯。 一、研究目的： 本研究以肝癌細胞Hep

5、G2.2.15為研究對象，通過IFN-α和5-FU對肝癌細胞凋亡信號傳導通路中的Bcl-xL、Fas、Caspase-8和BID及細胞周期調控的研究，揭示兩者的作用機制，并確定兩者聯合應用是否存在協(xié)同作用，從而減少5-FU的用量，降低其毒副作用，為臨床應用細胞因子和化療藥物聯合治療抗腫瘤、促凋亡提供理論依據。 二、研究方法： (1)用MTT法觀察化療藥5-FU和IFN-α對HepG2.2.15細胞增殖的影響，并篩選聯合用

6、藥的最佳劑量。IFN-α和5-FU單用藥組各設立6組不同濃度，作用48小時。根據單用藥組的增殖抑制情況選擇合適的聯合用藥組藥物濃度，進行動力學觀察。 (2)流式細胞術檢測藥物作用前后肝癌細胞周期和細胞凋亡變化：根據MTT結果篩選合適的藥物濃度進行分組：對照組，IFN-α組，5-FU組，IFN-α+5-FU聯合用藥組。藥物作用24h后，觀察細胞周期變化；48h后觀察細胞凋亡的改變。 (3)流式細胞術檢測藥物作用前后肝癌細胞

7、表面Fas表達變化：分組情況同(2)，藥物作甩48h后收集細胞觀察結果。 (4)RT-PCR檢測藥物作用凋亡抑制基因Bcl-XL表達變化：分組情況同(2)，藥物作用48h后收集細胞RT-PCR檢測。 (5)WesternBlot檢測藥物作用前后Caspase-8、BID、Cytc的變化。分組情況同(2)，藥物作用72小時后，收集各組細胞提取細胞總蛋白檢測。 (6)應用Fluo-3/AM熒光標記技術和激光掃描共聚焦

8、顯微鏡(LSCM)檢測不同組處理的HepG2.2.15細胞內游離鈣離子濃度的改變。 三、實驗結果： 1.IFN-α單獨應用對HepG2.2.15細胞的增殖抑制作用較弱，最大濃度時對細胞的增殖抑制率僅為17.1％。5-FU單用藥組的增殖抑制作用較強，根據實驗的結果選擇聯合用藥5-FU的濃度為10μg/mL，IFN-α的濃度為4000U/mL，兩藥聯合應用時對細胞的增殖抑制作用明顯增強，與單用藥組比較差異顯著，P＜0.01，

9、兩者存在協(xié)同作用。 2.兩者聯合應用對HepG2.2.15細胞周期的影響表現為與對照組和IFN-α、5-FU單用藥組相比，聯合用藥組G0/G1期細胞比率升高(54.95％、60.08％、72.50％)，S期比率降低(29.04％、18.69％、17.44％)，差異有顯著性，P＜0.01；經藥物處理48小時后，IFN-α組細胞凋亡率為7.15％±2.23％，5-FU組為20.42％±2.67％，明顯高于對照組的4.23％±2.01

10、％，P＜0.05，而聯合用藥組的細胞凋亡率為25.08％±2.54％，與對照組及IFN-α和5-FU單獨應用組相比，細胞凋亡率明顯增高，均為P＜0.01。 3.肝癌細胞HepG2.2.15表面Fas的表達較低，僅為1.79％。IFN-α對細胞表面Fas表達沒有影響，而5-FU則可提高細胞表面Fas的表達(6.91％)，兩者聯合應用時細胞表面Fas的表達率升高為8.75％，與對照組和單用藥組比較P＜0.01. 4.聯合用藥

11、組HepG2.2.15細胞Bcl-xL基因的表達較對照組和單藥組明顯下降；凋亡調控蛋白Caspase-8、Bid的活化增加，Cytc表達增強，聯合用藥組和對照組及單用藥組差異有顯著性(P＜0.05)。 5.IFN-α作用于肝癌細胞HepG2.2.1524h后，細胞內鈣離子的熒光強度由對照組的11.6±9.3增加到37.1±10.1，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；5-FU組鈣離子熒光強度與對照組比較無明顯變化。聯合用藥組的鈣離

12、子熒光強度為68.3±9.5，與IFN-α單用藥組和對照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01). 四、結論： 1.IFN-α單獨應用時對肝癌細胞的增殖抑制作用較弱，但與5-FU聯合應用可顯著提高對肝癌細胞的增殖抑制作用。 2.IFN-α和5-FU均可抑制肝癌細胞周期，并促進肝癌細胞的凋亡，其中協(xié)同用藥組較單藥組有更明顯的作用，說明IFN-α和5-FU在對肝癌細胞周期影響和促進腫瘤細胞凋亡方面存在著明顯的協(xié)同

13、作用。 3.在對肝癌細胞表面Fas表達的檢測中我們發(fā)現，5-FU可在一定程度上提高其Fas的表達，而IFN-α的作用不明顯，兩者有一定協(xié)同作用。 4.在基因水平，我們檢測了在內源性凋亡途徑中發(fā)揮作用的抗凋亡基因Bcl-xL在用藥前后的表達變化，發(fā)現兩種藥物均可引起B(yǎng)cl-xL的表達改變，兩藥聯合時具有協(xié)同作用。凋亡相關蛋白Caspase-8、Bid的活化明顯增強，Cytc表達增加。說明IFN-α聯合5-FU可通過調節(jié)兩條