瘦素促進(jìn)人肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和抗凋亡作用及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　 最近的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肥胖與原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌的關(guān)系密切，而肥胖人群體內(nèi)血清的瘦素水平增高，作為一種調(diào)節(jié)能量代謝的脂肪因子，瘦素也有生長(zhǎng)因子的作用，但其與肝癌的關(guān)系報(bào)道不多。本研究擬首先觀察瘦素及其受體在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)情況，接著觀察瘦素對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響并初步探討其可能的機(jī)制，為瘦素可能作為一種重要的生長(zhǎng)因子參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　

2、 (1)瘦素及其受體在人肝癌組織中表達(dá)情況的研究：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)28例原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中瘦素和瘦素受體蛋白的表達(dá),并就其表達(dá)與臨床病理組織學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行分析。
　　 (2)瘦素對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖活性的研究：以人肝癌細(xì)胞Huh 7為研究對(duì)象，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的瘦素后，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞

3、周期調(diào)控蛋白CyclinD1和P21 waf1的表達(dá)。
　　 (3)瘦素對(duì)阿霉素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的影響：用阿霉素作為凋亡誘導(dǎo)劑預(yù)處理Huh 7 細(xì)胞3h 后，在培養(yǎng)液中加入濃度為100ng/ml的瘦素，24h 后提取細(xì)胞DNA電泳檢測(cè)DNA ladder，Hochest33258 熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的表達(dá)情況。
　　 (4)

4、瘦素對(duì)人肝癌細(xì)胞體外侵襲、遷移能力的影響：用細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲重建基底膜實(shí)驗(yàn)觀察測(cè)瘦素(100 ng/ml)作用24 h 后對(duì)Huh 7 細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析瘦素對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)mRNA的影響。
　　 結(jié)果：
　　 (1)瘦素在肝癌組織和癌旁組織中的陽性率分別為82.14[％]和35.71[％]，瘦素受體在肝癌組織和癌旁組織

5、中的陽性率分別為78.57[％]和42.68[％]，瘦素及其受體在肝癌組織中的陽性率都高于癌旁組織，差別具有顯著性差異(P<0.01)。瘦素及其受體的表達(dá)與患者年齡、性別、HbsAg 陽性、抗-HCV 抗體陽性、伴有肝硬化與否、腫瘤大小、腫瘤分期和組織學(xué)分級(jí)均無相關(guān)性，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但瘦素及其受體的高低表達(dá)與腫瘤是否發(fā)生血管侵犯有關(guān)，發(fā)生血管侵犯的腫瘤的瘦素及其受體的表達(dá)率均高于未發(fā)生血管侵犯的腫瘤，其差別具有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (2)通過生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)，處理組的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，而且隨著瘦素濃度的增加，細(xì)胞數(shù)也增加，有一定的劑量依耐性；MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖顯示瘦素可以促進(jìn)Huh 7 細(xì)胞的增殖，有一定的時(shí)間和劑量依耐性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示瘦素能明顯降低G0/G1 期細(xì)胞比例并提高S 期細(xì)胞比例，細(xì)胞凋亡率也有明顯降低；
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot 法檢測(cè)顯示瘦素(100ng/m

7、l)處理24h 后，CyclinD1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增高，P21 waf1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 (3)瘦素能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比，瘦素處理組的DNA ladder 條帶明顯減弱，Hochest33258 熒光染色也發(fā)現(xiàn)瘦素處理組的凋亡細(xì)胞明顯減少，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的凋亡率是(47.77±2.90)[％]，而瘦素處理組的凋亡率是(30

8、.17±2.03)[％]，明顯下降(P<0.01)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-2 mRNA表達(dá)量增高至對(duì)照組的2.31 倍，Bax mRNA 表達(dá)量減弱至對(duì)照組的0.46 倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (4)瘦素(100ng/ml)處理24h 后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，瘦素處理組的細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞穿透聚碳酸酯膜的能力也顯著增強(qiáng)(41.80±3.19 對(duì)18.20±2.86，P<0.01)；實(shí)時(shí)

9、熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9 mRNA 表達(dá)量分別增高至對(duì)照組的4.25和2.73 倍(P 均<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)瘦素及其受體在肝癌組織中存在著高表達(dá)現(xiàn)象，發(fā)生血管侵犯的腫瘤的瘦素及其受體的表達(dá)率均高于未發(fā)生血管侵犯的腫瘤；用外源性瘦素直接干預(yù)人肝癌細(xì)胞系Huh 7 細(xì)胞，能明顯影響腫瘤細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)Cyclin D1 表達(dá)、抑制P21 waf