PRRSV nsp11抑制Ⅰ型干擾素信號通路的機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防線，其中Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β等）在抗病毒過程中扮演著重要作用。當(dāng)病毒入侵到宿主細(xì)胞后，病毒的病原相關(guān)分子模式（PAMPs）將被宿主細(xì)胞的模式識別受體（PRRs）識別，進(jìn)而活化下游信號分子，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)并分泌到細(xì)胞外。分泌的IFN-α/β將與細(xì)胞表面的異源二聚體受體（IFNAR1和IFNAR2）結(jié)合，激活胞內(nèi)兩個酪氨酸激酶(JAK1、TYK2)?；罨睦野?/p>

2、酸激酶使下游兩個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT1、STAT2）發(fā)生磷酸化，進(jìn)而形成異源二聚體，然后與干擾素調(diào)節(jié)因子9（IRF9）形成干擾素刺激基因因子3(ISGF3)。ISGF3轉(zhuǎn)入細(xì)胞核后，結(jié)合到干擾素刺激應(yīng)答元件（ISREs）上，從而誘導(dǎo)數(shù)以百計(jì)的干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終為宿主建立起抗病毒狀態(tài)。
　　豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的免疫抑制性疾病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造

3、成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。已有研究表明，PRRSV進(jìn)化出一系列逃避宿主免疫的機(jī)制，能通過多種策略拮抗Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。PRRSV編碼蛋白nsp1α/1β、nsp2、nsp4、nsp11和N蛋白均能夠抑制干擾素的產(chǎn)生。同時，PRRSV也可以抑制Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前只有nsp1β和N蛋白有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，然而對其他PRRSV編碼蛋白抑制Ⅰ型干擾素信號通路的作用機(jī)制還不清楚。
　　PRRSV nsp11具有套式病毒的特異性尿嘧啶核糖核酸內(nèi)切

4、酶(NendoU)活性，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。本研究以PRRSV nsp11為研究對象，探究其在Ⅰ型干擾素信號通路中的作用，并解釋其作用機(jī)制，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.PRRSV nsp11及其核糖核酸內(nèi)切酶活性缺失突變體抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISRE啟動子活化和ISGs的表達(dá)
　　為了探討PRRSV nsp11是否具有抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISRE啟動子活化和ISGs的表達(dá)的能力，我們將nsp11及其核糖核酸內(nèi)切酶

5、活性缺失突變體(H129A、H144A、K173A)真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和熒光定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，nsp11及其突變體都可以抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISRE啟動子活化和ISGs的表達(dá)。說明nsp11能夠抑制Ⅰ型干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且該抑制作用不依賴于nsp11的核糖核酸內(nèi)切酶活性。為了進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制，將nsp11以及其突變體(H129A、H144A、K173A)真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染

6、HEK-293T細(xì)胞，用IFN-α刺激6h。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRRSV nsp11及其突變體不影響STAT1、STAT2的磷酸化，也不影響STAT1、STAT2和IRF9的表達(dá)。然后將nsp11及其突變體(H129A、K173A)真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，用IFN-α刺激6h后，分別提取細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白樣品。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，nsp11及其突變體(H129A、K173A)能夠抑制ISGF3

7、復(fù)合體成分p-STAT1、p-STAT2和IRF9的入核。
　　2.PRRSV nsp11及其核糖核酸內(nèi)切酶活性缺失突變體與IRF9存在相互作用
　　STAT1、SATA2、和IRF9在Ⅰ型干擾素信號通路中扮演著重要角色，可以形成ISFG3復(fù)合體，入核后將起始ISGs的表達(dá)。為了探究nsp11如何抑制ISGF3復(fù)合體入核，我們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測nsp11是否與ISGF3主要成分（STAT1、STAT2和IRF9）存在相互

8、作用。將nsp11或突變體（H129A、H144A和K173A）分別與STAT1、STAT2、IRF9真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， nsp11和突變體都能與IRF9發(fā)生相互作用。為了進(jìn)一步鑒定nsp11與IRF9的互作結(jié)構(gòu)域，首先構(gòu)建了4個IRF9不同區(qū)域缺失的截短突變體。將nsp11或H129A真核表達(dá)質(zhì)粒分別與IRF9不同區(qū)域缺失的截短突變體真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

9、結(jié)果表明，nsp11和及其突變體(H129A)與IRF9的IAD結(jié)構(gòu)域存在相互作用。
　　3.PRRSV nsp11及其核糖核酸內(nèi)切酶活性缺失突變體抑制ISGF3誘導(dǎo)的ISRE啟動子活化
　　由于STAT2也與IRF9的IAD結(jié)構(gòu)域存在相互作用，nsp11和STAT2很可能競爭性與IRF9結(jié)合。為探究nsp11是否抑制ISGF3復(fù)合體的形成，將nsp11或突變體(H129A)真核表達(dá)質(zhì)粒分別與ISGF3關(guān)鍵分子(STAT1、

10、STAT2和IRF9)的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞，用IFN-α刺激6h。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRRSV nsp11及其突變體(H129A)能夠抑制IFN-α誘導(dǎo)的ISGF3形成。為探究nsp11抑制ISGF3形成的生物學(xué)效應(yīng)，將nsp11、突變體（H129A、H144A和K173A）和ISGF3復(fù)合體(STAT1、STAT2和IRF9)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果表明， nsp11

11、及其突變體（H129A、H144A和K173A）能顯著地抑制ISGF3誘導(dǎo)的ISRE啟動子活化。
　　綜上所述，本研究以PRRSV nsp11為研究對象，探討其在拮抗Ⅰ型干擾素信號通路中的作用，發(fā)現(xiàn)PRRSV nsp11抑制ISRE啟動子活化和ISGs的表達(dá)，然而其抑制ISRE啟動子活化的能力不依賴于其內(nèi)切核糖核酸酶活性，進(jìn)一步研究表明PRRSV nsp11及其突變體與ISGF3重要成分IRF9的IAD區(qū)域互作，從而抑制ISGF3