Klotho高表達(dá)抑制肝癌進(jìn)展并通過下調(diào)Wnt-β-catenin信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究背景:肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在目前已知所有癌癥中，死亡率排在第三位。原發(fā)性肝癌主要包括兩種病理類型:肝細(xì)胞肝癌和膽管細(xì)胞型肝癌。肝癌不僅給患者帶來病痛及心理的負(fù)擔(dān)，同時也給患者家庭和社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)壓力，因此肝癌已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　Kuro-o等發(fā)現(xiàn)Klotho基因缺陷小鼠可出現(xiàn)多種衰老癥狀，而Klotho的超表達(dá)則可延長小鼠的壽命。Klotho基因位于人的染色體13q12區(qū)域，大小為50kb。它編碼單次跨

2、膜蛋白，其由胞外結(jié)構(gòu)域、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域非常短并且沒有明確的功能。膜型Klotho蛋白作為成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF23)的專屬受體可調(diào)節(jié)磷酸鹽穩(wěn)態(tài);細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（分泌型Klotho）可被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，起到循環(huán)激素的作用，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及多種生長因子受體和離子通道。Klotho在乳腺癌進(jìn)展中的抗腫瘤作用在2008年首次被認(rèn)定，最近數(shù)年，已經(jīng)有很多文獻(xiàn)研究探尋Klotho基因的表達(dá)與癌癥進(jìn)展之間的關(guān)系，然

3、而該基因在癌癥中的作用機(jī)制尚未明確。研究表明Klotho的表達(dá)在幾種實體瘤中廣泛下調(diào)，包括子宮頸癌，胰腺癌，黑素瘤和消化道腫瘤，其也參與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制。在這些惡性腫瘤中，Klotho被闡明是幾種信號通路的調(diào)節(jié)劑，包括FGF信號傳導(dǎo)，胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和Wnt途徑， Lu等對189個卵巢上皮癌患者進(jìn)行了臨床隨訪，結(jié)果顯示分泌型Klotho基因的高表達(dá)與癌癥的進(jìn)展、癌癥患者的死亡及IGF-Ⅰ和IGFBP-3

4、的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在Wang等的報道中提到，作為一種新的抑癌基因，Klotho在胃癌中通過甲基化逐漸被滅活，對甲基化的Klotho蛋白的檢測可以用來預(yù)測胃癌患者的預(yù)后。在結(jié)腸癌患者中，Klotho基因的下調(diào)與癌癥的侵襲性及Dukes分期有關(guān)，而Klotho基因的超表達(dá)則可通過IGF1R介導(dǎo)的PI3K/AKT信號途徑來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲。另外，Klotho可以抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力，在宮頸癌的體外模型中Klotho的表達(dá)通過

5、上調(diào)E-鈣粘蛋白和下調(diào)N-鈣粘蛋白及減少M(fèi)MP-7和MMP-9的表達(dá)來降低癌癥細(xì)胞的游走及侵襲能力。Zhou等的研究表明，Klotho能有效抑制大B淋巴細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞的生長，Klotho的超表達(dá)能顯著抑制大B細(xì)胞淋巴瘤中腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，他們還發(fā)現(xiàn)在大B細(xì)胞淋巴瘤腫瘤細(xì)胞中阿霉素與重組人Klotho蛋白聯(lián)合使用能增強(qiáng)它們抗腫瘤的功效，研究表明，通過轉(zhuǎn)染Klotho載體途徑實現(xiàn)的Klotho的高表達(dá)可顯著抑制大B細(xì)胞淋巴瘤的移

6、植物模型的腫瘤細(xì)胞生長。
　　研究表明一些炎癥因子可下調(diào)Klotho水平，同時Klotho也可反過來調(diào)節(jié)、抑制一些炎癥因子（如TNF-α）的作用。在這方面，Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨诟伟┑陌l(fā)病機(jī)理中具有關(guān)鍵作用。據(jù)報道分泌型Klotho蛋白通過結(jié)合Wnt配體來阻止Wnt結(jié)合其同源細(xì)胞表面受體而達(dá)到抑制Wnt信號的作用。隨著肝功能的衰竭，Klotho作為Wnt拮抗劑來誘導(dǎo)Klotho基因突變增強(qiáng)Wnt信號傳導(dǎo)通路

7、。
　　然而，Klotho基因與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系現(xiàn)在仍未闡明，探索肝癌的進(jìn)展中Klotho基因的作用及可能的機(jī)制對肝癌的基礎(chǔ)研究具有重要意義，我們期待明確其功能及其作用機(jī)制以便為肝癌患者的生物治療提供治療靶點(diǎn)。
　　目的:1.通過運(yùn)用MTT試驗，逆轉(zhuǎn)錄PCR，克隆形成實驗，流式細(xì)胞分析及免疫印跡分析法等方法檢測分析Klotho超表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　2.探討Klotho表達(dá)和Wnt/β-cat

8、enin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間關(guān)系。
　　方法:1.通過MTT試驗檢測肝癌細(xì)胞的增殖。將肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721細(xì)胞接種在48孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)8個小時，將pCMV6-Klotho和p CMV-6載體轉(zhuǎn)染載入細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72和96小時。最后，將MTT試劑加入培養(yǎng)液中，這種藍(lán)紫色結(jié)晶就會溶解在DMSO中。將這種溶解液倒置在96孔板中，檢測490nm和570nm之間波長的各孔的吸光值。
　　2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄P

9、CR檢測肝癌細(xì)胞中Klotho mRNA的含量，使用RNA提純試劑盒用來提純所有的RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶Super-ScriptⅢ轉(zhuǎn)錄cDNA。原始序列式是:GAPDH,5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'和5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'和Klotho蛋白，5'-ACCTGG-TGGCGCACAACC-3'和5-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3' Klotho的PCR反應(yīng)是在94℃中進(jìn)行5分鐘，

10、然后在94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒共30個循環(huán)。最后，在72℃中進(jìn)行10分鐘。GAPDH的反應(yīng)條件與Klotho相似，但退火溫度為55℃30秒。
　　3.在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pCMV6-Klotho載體，在穩(wěn)定細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入pCMV-6細(xì)胞系。在克隆形成試驗中，將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中。在8小時后，將Klotho及對照組的載體轉(zhuǎn)染載入對應(yīng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)14天。培養(yǎng)液每3天更換一次。用甲醇來固定這些集落。用1.25％的龍膽紫著色，

11、然后在高倍鏡下計數(shù)。
　　4.流式檢測分析用來測定肝癌細(xì)胞的凋亡，根據(jù)試劑盒說明書，利用Ⅴ-FITC/PI膜連蛋白雙染色。將轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho和pCMV6載體的肝癌細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)48小時。將細(xì)胞用冰PBS培養(yǎng)液清洗3次，然后懸浮于HEPES-NaOH10 mM pH7.4，25 mM CaCl2和144 mM NaCl的混合培養(yǎng)液中。最后，在黑暗環(huán)境中冰上用AnnexinⅤ和PI進(jìn)行染色30分鐘，然后將這些細(xì)胞進(jìn)行流

12、式細(xì)胞分析。
　　5.通過免疫印跡分析法檢測Klotho，β-catenin，C-myc和CyclinD1的表達(dá)，將肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移在48孔板中，培養(yǎng)8小時至它們粘連在一起。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入pCMV6-Klotho和p CMV-6載體48小時。轉(zhuǎn)入pCMV6載體的細(xì)胞作為對組。實驗組是轉(zhuǎn)入rKlotho或者BSA（濃度為250 ng/mL）的細(xì)胞。BSA作為負(fù)向的對照組。然后將細(xì)胞用冰水PBS沖洗，用細(xì)胞裂解液做電泳分析。
　　結(jié)果:

13、1.在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Klotho低水平表達(dá)，用逆轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印記分析法測定四種肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性Klotho水平并與永生型的LO2肝細(xì)胞相比，檢測到Bel-7404和HepG2，SMMC-7721等肝癌細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)含量更低。
　　2.轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho載體的HepG2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞培養(yǎng)24，48，72，96小時，在OD490nm可見轉(zhuǎn)入p CMV6-Klotho的細(xì)胞數(shù)要比轉(zhuǎn)入p CMV6載體

14、的細(xì)胞數(shù)低，Klotho超表達(dá)明顯的抑制了細(xì)胞的增殖能力。將重組Klotho轉(zhuǎn)入SMMC-7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中培養(yǎng)24，48，72，96小時后，可見重組Klotho可明顯抑制肝癌細(xì)胞系HepG2的SMMC-7721增殖，更高含量的klotho具有更明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。Klotho的超表達(dá)及重組的Klotho均具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。
　　3.克隆形成試驗顯示Klotho基因表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，將對照載體(

15、pCMV6)和pCMV6-Klotho轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721中，培養(yǎng)10天后可見轉(zhuǎn)入pCMV Klotho的肝癌細(xì)胞克隆數(shù)要比轉(zhuǎn)入對照組載體的數(shù)目明顯減少。Klotho的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，Klotho作為一個潛在的腫瘤抑制因子具有重要的腫瘤抑制作用。
　　4.用流式細(xì)胞分析（PI和AnnexinⅤ-FITC雙染色）鑒定Klotho的超表達(dá)對肝癌細(xì)胞凋亡的影響。轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho載體的HepG2細(xì)

16、胞系的凋亡率比對照組明顯增高(P＜0.01)，與做同樣處理的SMMC-7721細(xì)胞系結(jié)果一致，表明Klotho蛋白可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。
　　5.在肝癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在異常。在肝癌細(xì)胞HepG2中轉(zhuǎn)染p CMV6-Klotho和對照組載體pCMV6，用免疫印跡分析法測定Klotho，β-catenin，C-myc和Cyclin D1的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho的肝癌細(xì)胞HepG2中K

17、lotho的表達(dá)水平更高，而β-catenin，C-myc和Cyclin D1的表達(dá)水平更低。這與肝癌細(xì)胞HepG2中轉(zhuǎn)入Klotho并培養(yǎng)48小時后的結(jié)果一致。Klotho的高表達(dá)同時伴有β-catenin，C-myc和Cyclin D1的低表達(dá)。表明在HepG2細(xì)胞中Klotho的表達(dá)水平與Wnt/β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路呈負(fù)相關(guān)。
　　6.Klotho的超表達(dá)可降低內(nèi)源性β-catenin的含量和抑制細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，

18、β-catenin轉(zhuǎn)錄進(jìn)入細(xì)胞核激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在pCMV-Klotho轉(zhuǎn)錄的HepG2細(xì)胞中，β-catenin的含量與對照組相比在細(xì)胞質(zhì)中明顯增高。在pCMV6-Klotho轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均明顯的降低，C-myc和Cyclin D1的表達(dá)水平也降低。所有數(shù)據(jù)表明，Klotho的超表達(dá)減少了β-catenin的內(nèi)源性表達(dá)，也抑制了β-catenin從細(xì)胞質(zhì)經(jīng)載體載入細(xì)胞核