cGMP的心肌保護作用及自噬在MIRI中的作用.pdf

1、第一部分:環(huán)磷酸鳥苷的心肌雙重保護作用及其機制的探討
　　環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine3’5’-monophosphate，cGMP）是細胞內一種第二信使，是由可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanosine cyclase，sGC）和顆粒狀鳥苷酸環(huán)化酶（particulate guanylyl cyclase，pGC）催化GTP轉化而生成。作為一種重要的細胞內信使物質，cGMP有3個主要靶點：cGMP-依賴

2、的蛋白激酶或蛋白激酶G（proteinkinase G，PKG），cGMP-調節(jié)的cAMP磷酸二酯酶，以及cGMP控制的離子通道。其中，PKG被認為是最重要的cGMP下游靶點。在生理條件下，PKG通過松弛平滑肌細胞、抑制內皮細胞通透性、抑制血小板活化以及對心肌細胞的負性肌力作用保護心血管系統(tǒng)。最近有研究報道，cGMP/PKG信號途徑在缺血預處理和后處理的心臟保護機制中發(fā)揮重要作用。另有報道指出，磷酸二酯酶-5抑制劑西地那非（silden

3、afil，偉哥）通過增加cGMP的積聚激活PKG，進而保護缺血/再灌注的心肌細胞。然而cGMP/PKG信號途徑保護心臟的具體機制尚不清楚。
　　目前研究認為，線粒體膜通透性轉移孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放是導致缺血/再灌注損傷的關鍵因素，抑制mPTP的開放是許多心臟保護物質抗缺血/再灌注損傷的共同機制。雖然有人提出，mPTP可能是cGMP/PKG信號途徑

4、引起心臟保護的最終靶點，但尚未被證實。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）在心肌保護中也起非常重要的作用，其機制主要是通過Ser9位點的磷酸化抑制其活性，從而阻止mPTP的開放并保護再灌注損傷的心肌。已有研究證明，西地那非通過PKG信號通路使心肌細胞GSK-3β失活。推測，cGMP很可能通過GSK-3β的失活抑制mPTP的開放。磷脂酰肌醇三激酶（phosphoinositide3-ki

5、nase，PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號途徑抑制GSK-3β的活性，并有報道此途徑可能被西地那非激活。同樣可以設想，cGMP/PKG信號可能通過PI3K/Akt使GSK-3β失活。PI3K/Akt的激活雖對缺血預處理心臟起保護作用，但是過度的Akt活化可以誘發(fā)病理性心室重構和心力衰竭。因此，探討cGMP對Akt活性的影響及其可能機制具有重要意義。
　　本實驗利用 H9c2大鼠心肌細胞株，探討 cGMP的心臟保護作用是否通過G

6、SK-3β的失活并抑制 mPTP開放而引起，并進一步觀察 cGMP是否通過影響Akt的活性使GSK-3β失活。
　　為了探討cGMP能否使GSK-3β失活，本研究用cGMP類似物8-Br-cGMP（500μmol/L）處理H9c2細胞30 min，利用Western blotting方法觀察GSK-3βSer9位點磷酸化的情況。結果顯示，8-Br-cGMP明顯增加GSK-3β的磷酸化，表明cGMP能夠抑制GSK-3β的活性。因為P

7、KG是cGMP的重要下游因子，本實驗通過測定 PKG的主要底物血管擴張刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）的磷酸化水平檢測了PKG的活性。結果顯示，8-Br-cGMP明顯增加VASP的磷酸化，提示8-Br-cGMP能夠激活PKG。cGMP抑制GSK-3β活性的效應被特異性PKG抑制劑KT5823（10μmol/l）所逆轉，提示cGMP是通過PKG抑制GSK-3β的活性。進一步

8、的實驗顯示，8-Br-cGMP本身并不能明顯增強GSK-3β磷酸化，而必須和PKG Iα共同作用時才表現(xiàn)出增加GSK-3β磷酸化的作用，進一步證實了cGMP通過PKG抑制GSK-3β的活性。同樣，8-Br-cGMP與PKG Iα的直接相互作用使純化GSK-3β的磷酸化明顯增加。以上結果表明cGMP通過PKG使GSK-3β失活。
　　為了探討cGMP能否阻止mPTP開放，本實驗利用激光共聚焦顯微鏡成像技術和熒光染色方法（四甲基羅丹明

9、乙酯tetramethyrhodamine ester，TMRE）測定了線粒體膜電位，以此判斷mPTP的開放程度。結果顯示，cGMP明顯抑制氧化應激誘導的TMRE熒光強度的減少，說明cGMP能夠抑制mPTP的開放。用激活型GSK-3β質粒（GSK-3β-S9A）轉染細胞，使GSK-3β處于持續(xù)激活狀態(tài)后，cGMP沒能抑制TMRE熒光強度的減少。由于抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的開放，此結果進一步證明cGMP通過抑制GSK-3β活

10、性而阻止mPTP的開放。
　　為了進一步闡明 cGMP是否通過影響 Akt活性而使 GSK-3β失活，實驗用Western blotting檢測了Akt Ser473位點的磷酸化。我們意外地發(fā)現(xiàn)，8-Br-cGMP不能增加Akt的磷酸化，反而使其減少，提示cGMP的積聚可迅速抑制Akt的活性。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，我們進一步檢測了非特異性磷酸二酯酶抑制劑異丁基甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX

11、，200μmol/L）能否模擬cGMP的這種作用而抑制Akt的磷酸化。結果表明，IBMX使Akt的磷酸化明顯減少，卻增強VASP的磷酸化，表明IBMX通過cGMP抑制Akt的活性。進一步的實驗結果顯示，8-Br-cGMP也阻斷胰島素對Akt的磷酸化效應，提示cGMP不僅抑制Akt基礎活性，也抑制配體誘發(fā)的Akt活化。因為Akt的過度激活可導致心肌肥大和心力衰竭，本實驗結果可能提示，cGMP可防止心衰的發(fā)生。本實驗中還發(fā)現(xiàn)cGMP對Akt

12、磷酸化的抑制作用不能被PKG的抑制劑KT5823所逆轉，并且PKG的RNA敲除亦不能影響cGMP對Akt磷酸化的抑制效應，說明雖然PKG作為cGMP的重要下游信號，通過使GSK-3β失活而阻止mPTP的開放，但并不參與cGMP對Akt的負性調節(jié)作用。
　　Thr308和Ser473位點的磷酸化使Akt活化，而絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶使這些殘基去磷酸化而導致Akt的失活。因此，我們探討了cGMP是否通過激活絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶而

13、使 Akt失活。結果顯示，絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶抑制劑Calyculin A（5nmol/L）使Akt Ser473位點磷酸化明顯增加，且此效應被8-Br-cGMP所阻斷，提示cGMP能活化絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶，從而導致Akt失活。為了進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，我們利用比色法進一步檢測了蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的活性。結果顯示，8-Br-cGMP使PP2A活性明顯增加。這些結果均表明，cGM

14、P通過激活蛋白激酶磷酸酶尤其是PP2A而抑制Akt的活性。
　　小結：
　　1. cGMP通過PKG抑制GSK-3β的活性并阻止mPTP的開放，從而保護心臟；
　　2. cGMP對Akt活性起負性調節(jié)作用；
　　3. cGMP抑制Akt的活性主要通過激活PP2A，而不是通過PKG信號通路；
　　4. cGMP對心肌的生存具有雙重調節(jié)作用。
　　第二部分:自噬在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其機制研究

15、r>　　缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是嚴重威脅人類健康的最常見疾病之一。IHD的基本病理生理過程是心肌缺血，在其治療過程中再灌注會引發(fā)缺血區(qū)功能障礙加重和結構損傷，稱為再灌注損傷（reperfusion injury）。有效防治再灌注損傷已成為醫(yī)學界亟待解決的重要課題。再灌注損傷的發(fā)生機制十分復雜，且尚未完全闡明。普遍認為，自由基、鈣超載、心肌能量代謝障礙、炎性反應與細胞凋亡等在再灌注損傷中起重要

16、作用。自噬（Autophagy）作用是廣泛存在于大部分真核細胞中的一種生命現(xiàn)象，是溶酶體對自身結構的吞噬降解，它是細胞內的再循環(huán)系統(tǒng)。細胞在基礎狀態(tài)下有自噬活動，同時各種應激如饑餓和低氧癥也可以誘發(fā)自噬。自噬是一種細胞生存機制，但在某些條件下也導致細胞死亡（自噬性死亡或Ⅱ型程序性死亡）。最近的研究表明，心肌缺血/再灌注時可誘發(fā)自噬，但其發(fā)生的時期和具體作用尚不清楚。弄清缺血/再灌注過程中自噬啟動時期及強度的演變，對再灌注損傷的防治可能起

17、重要的指導作用。自噬的調控主要是由Ⅰ型和Ⅲ型磷酸肌醇三磷酸激酶（PI3K）來完成，其中Ⅰ型PI3K通過激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）來抑制自噬的發(fā)生，即負性調節(jié)機制；自噬的另一種調節(jié)方式為mTOR非依賴性調節(jié)機制，也稱為正性調節(jié)機制，是Ⅲ型PI3K通過增加Beclin l蛋白的表達而誘發(fā)。LC3是Atg8在哺乳動物中的同源物，已被明確參與自噬過程。LC3有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ

18、兩種亞型，其中LC3-Ⅰ是胞漿蛋白，LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是自噬體形成數(shù)量的重要標志。了解心肌缺血/再灌注時自噬發(fā)生的調控機制，有助于認識再灌注損傷的發(fā)病機制，并有助于尋找治療再灌注損傷的有效方法?；谝陨侠碚?，本研究初步探討了心肌缺血/再灌注時自噬的發(fā)生時期、自噬在再灌注損傷中的具體作用以及其調控機制。
　　本實驗首先用Langendorff裝置制備大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型，在缺血0

19、、10、20和30 min時和再灌注10、30、60和120 min時采集心臟組織標本，用Western blotting方法檢測LC3蛋白的表達。結果顯示，在缺血期LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值雖有增加趨勢，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，自噬活動并沒有加強。而在再灌注期不同時間點自噬活動均顯著加強，說明自噬在心肌再灌注損傷中起一定作用。
　　為了進一步探討自噬在再灌注損傷中的確切作用，本研究觀察了3-甲基腺嘌呤（3-methyla

20、denine，3-MA）和腺苷受體激動劑（N-Ethylcarboxamidoadenosine，NECA）對自噬和心肌梗死的影響。3-MA為特異性自噬抑制劑，而NECA則為腺苷A2受體擬似劑，是公認的心臟保護物質。再灌注5 min之前開始用3-MA和NECA進行干預并持續(xù)35 min。于再灌注10、30、60和120 min時采集心臟組織標本，用Western blotting檢測LC3蛋白的表達，以觀察3-MA和NECA對自噬的影響

21、。再灌注120 min結束后，TTC染色法測定心肌梗死面積以觀察兩種干預藥物對心肌梗死面積大小的影響，推測自噬在再灌注損傷中的具體作用。結果顯示，3-MA抑制再灌注損傷誘發(fā)的自噬，并減少心肌梗死面積，說明自噬在心肌再灌注損傷中起有害作用。NECA既能抑制自噬，同時也減輕再灌注引起的心肌梗死。這說明NECA抑制自噬活動可能是其保護再灌注心臟的機制之一。
　　為了探討再灌注誘發(fā)自噬的機制，本研究用Western blotting方法分

22、別檢測了缺血期和再灌注期Beclin1和mTOR的活性。結果顯示，在缺血期和再灌注期，Beclin1蛋白的表達均沒有增加，反而出現(xiàn)了下降的趨勢。Beclin1是自噬正性調節(jié)機制中的關鍵基因，說明在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型中，自噬的發(fā)生并不主要依賴于其正性調節(jié)機制。進一步實驗顯示，mTOR的活性在缺血期和再灌注期均降低，說明負性調節(jié)機制的減弱可能是誘發(fā)自噬的原因。
　　小結：
　　1.在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型