葒草苷抗MIRI作用中的自噬機(jī)制研究.pdf

1、本文對葒草苷抗MIRI作用中的自噬機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：葒草苷預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的實驗研究。
　　 目的：建立大鼠離體心臟缺血再灌注模型，研究葒草苷(orientin，Ori)對心肌血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的預(yù)防性作用，旨在為Ori的開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法：70只雄性wistar大鼠隨機(jī)分

2、為7組:對照組(Con)、模型組(Mod)、白藜蘆醇組(Res)、葒草苷小劑量組(1 mg/kg Ori)、中劑量組(2 mg/kg Ori)和大劑量組(4 mg/kg Ori)，另設(shè)葒草苷+自噬抑制劑組(2 mg/kg Ori+Wortmannin15μg/kg，OW)。腹腔注射給藥7天，實驗開始前30 min腹腔注射自噬抑制劑。建立Langendorff離體心臟缺血再灌注模型，采用16道生理記錄儀采集血流動力學(xué)指標(biāo);自動生化分析儀檢

3、測灌流液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和肌酸肌酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)活性;光鏡觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變;電鏡觀察大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：⑴缺血再灌注能引起大鼠血流動力學(xué)參數(shù)明顯變化，再灌注120 min后模型組大鼠冠脈流量(coronary flow，CF)、左室發(fā)展壓(leftventricular developed pressure，L

4、VDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)均有不同程度下降，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);再灌注120 min后模型組大鼠心臟灌流液中LDH及CK-MB漏出率顯著升高，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);光鏡下觀察心肌組織切片，模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大腫脹，細(xì)胞間質(zhì)嚴(yán)重水腫，肌纖維排列紊亂，大量心肌纖維溶解斷裂等;電鏡下觀察到模型組大鼠心肌細(xì)胞中肌絲排列紊亂，肌原纖

5、維溶解斷裂，線粒體腫脹，嵴密集度降低且排列紊亂。⑵預(yù)防性腹腔注射Ori連續(xù)7天，可改善再灌注120 min后大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)，腹腔注射4 mg/kg Ori可使CF從(6.15±1.27) mL/min升高至(8.20±1.72) mL/min，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);腹腔注射2 mg/kg Ori及4 mg/kg Ori可使LVDP由(32.73±6.71)mmHg分別升高至(47.32±8.77) mmHg和(

6、46.52±9.50) mmHg，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01和P＜0.01);腹腔注射2 mg/kg Ori及4mg/kg Ori可使+dp/dtmax由(1373.58±371.31)mmHg/s分別升高至(2127.41±314.25) mmHg/s和(1986.76±348.08) mmHg/s，比較結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001和P＜0.01）;腹腔注射2 mg/kg Ori及4 mg/kgOri可使-dp/dtm

7、ax由(-677.76±107.42) mmHg/s分別升高至(-956.30±186.71) mmHg/s和(-951.26±192.17) mmHg/s，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01和P＜0.01)。⑶與模型組比較，連續(xù)7天預(yù)防性腹腔注射Ori可降低再灌注后大鼠心肌灌流液中的LDH和CK-MB水平:再灌注30 min后，1、2、4 mg/kg葒草苷可使灌流液中的LDH含量從(53.40±7.54) U/L分別降至(18.1

8、7±2.56，14.72±1.37和14.22±1.49) U/L，比較結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.001，P＜0.001和P＜0.001)，使CK-MB水平由(24.58±4.55)U/L分別降至(7.33±0.84，7.87±1.507.40±1.74) U/L，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001和P＜0.001）;再灌注60 min后，1、2、4 mg/kg葒草苷可使灌流液中的LDH含量從(42.50±6.53

9、)U/L分別降至（10.33±1.41，9.50±0.71和10.72±0.80）U/L，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05和P＜0.01），使CK-MB含量由(14.28±2.22) U/L分別降至(3.97±1.27，4.08±0.96和6.08±1.47) U/L，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01和P＜0.01）;再灌注120 min后，1、2、4 mg/kg葒草苷可使灌流液中的LDH含量從(83

10、.75±10.12)U/L分別降至（13.83±0.83，14.56±0.51和15.06±1.83）U/L，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.01和P＜0.01)，使CK-MB含量由(29.30±4.01)U/L分別降至(5.67±0.47，7.33±1.54和6.87±1.86) U/L，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01和P＜0.05)。⑷與2 mg/kg葒草苷組比較，加用自噬抑制劑Wortmannin

11、后再灌注120 min的LVDP及±dp/dtmax數(shù)值均低于2mg/kg葒草苷組，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，灌流液中的LDH及CK-MB含量均高于2 mg/kg葒草苷組，比較結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。⑸與模型組比較，HE染色切片下觀察發(fā)現(xiàn)，葒草苷可減輕MIRI大鼠心肌纖維變性壞死以及細(xì)胞水腫的程度;電鏡觀察到葒草苷組心肌結(jié)構(gòu)損傷程度減輕，肌原纖維排列較為整齊，肌節(jié)完整清晰，改善線粒體腫脹及嵴紊亂現(xiàn)象。

12、　　 結(jié)論：葒草苷能明顯改善大鼠離體心臟MIRI的血流動力學(xué)指標(biāo)、心肌酶LDH及CK-MB漏出率及心肌病理損傷程度，對MIRI具有良好的預(yù)防性作用。自噬抑制劑Wortmannin明顯減弱了葒草苷的心肌保護(hù)作用。
　　 第二部分：葒草苷通過AMPK-mTOR途徑抗心肌缺血再灌注損傷的自噬機(jī)制研究。
　　 目的：探討葒草苷對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷心肌組織中自噬水平以及mTOR的影響，為葒草苷防治心臟缺血再灌注損傷提供實

13、驗依據(jù)。
　　 方法：建立大鼠離體心臟缺血再灌注模型，取左心室進(jìn)行心肌組織勻漿，采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Westem blot)技術(shù)檢測LC3（Microtubule-associate Protein1 Light Chain3，自噬基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）、mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)及AMPK（AMP-activated kinase，AMP活化蛋白激酶）的蛋

14、白表達(dá)及磷酸化水平，并采用凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析;電鏡觀察左心室組織中自噬體的形態(tài)。
　　 結(jié)果：⑴與對照組相比，模型組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.01）、p-mTOR Ser2448/mTOR比值降低（P＜0.01）、p-AMPK Thr172/AMPK比值升高（P＜0.01）。⑵腹腔注射1、2、4 mg/kg葒草苷可使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值從(0.58±0.12)分別升至（0.71±0.11，0.74±0.17

15、和0.81±0.13），比較結(jié)果具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.05和P＜0.01）;可使p-mTOR Ser2448/mTOR比值從(0.17±0.02)分別降至(0.13±0.03，0.12±0.01和0.11±0.02)，比較結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.01和P＜0.01);可使p-AMPKThr172/AMPK比值從(0.26±0.03)分別升至（0.33±0.03，0.35±0.04和0.38±0.05），

16、比較結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01)。⑶與2 mg/kg Ori相比，加用自噬抑制劑后導(dǎo)致LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P＜0.01)、p-mTOR Ser2448/mTOR比值升高（P＜0.01）、p-AMPKThr172/AMPK比值降低（P＜0.01）。⑷電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組中均可以觀察到處于不同時期的雙層膜包裹的自噬體結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：葒草苷可以上調(diào)大鼠離體MIRI心臟組織中自噬的自噬水平