金屬硫蛋白的心肌保護(hù)機(jī)制研究——自噬和凋亡的作用.pdf

1、心血管疾病目前已成為威脅人類健康與生命的頭號殺手,其發(fā)病率和死亡率超過腫瘤性疾病躍居第一。我國每年約有300余萬人死于心血管疾病,占全部死亡原因的40％。而心血管疾病機(jī)制復(fù)雜,目前仍不明確,因此,針對心血管疾病的防治作用研究顯得尤為重要。
　　眾所周知,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是蛋白質(zhì)的合成、折疊和轉(zhuǎn)運。約有三分之一的細(xì)胞蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成,因此維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是保證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的必備條件。但有很多因素可導(dǎo)致內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡,形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

2、激,例如:缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、物理和化學(xué)因素等。過去10年的研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制。近年來隨著工作和生活壓力的增大,高血壓的發(fā)病率逐年升高。2013年我國高血壓防治指南數(shù)據(jù)顯示,每5名成年人中就有1名高血壓患者。而越來越多的文獻(xiàn)也報道,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了高血壓的病理生理過程,但其機(jī)制復(fù)雜至今尚未完全明確。研究證實,一種富含半胱氨酸,具有結(jié)合金屬能力的重金屬清除劑,金屬硫蛋白(Metallothionein

3、,MT)具有良好的心臟保護(hù)功能,特別是在衰老、肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病性心臟病中,通過清除過多的活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS),恢復(fù)氧化-還原平衡,實現(xiàn)有效的心臟保護(hù)。近來有文獻(xiàn)報道,降低氧化應(yīng)激,可以有效地保護(hù)線粒體功能,從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此我們提出假說,金屬硫蛋白是否可以有效減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的心肌損傷,闡明這一問題將會為心肌損傷的機(jī)制研究提供新的視角和理論依據(jù)。
　　本課題擬在前期工作及已有文獻(xiàn)報道基礎(chǔ)

4、上,首先通過研究金屬硫蛋白對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致心肌損傷是否具有保護(hù)作用,探討自噬和凋亡在這一過程中的可能作用;進(jìn)而觀察MT對高血壓心肌損傷的保護(hù)作用,最后從線粒體水平探討心肌損傷的機(jī)制。
　　第一部分金屬硫蛋白減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后心肌損傷的機(jī)制研究實驗一自噬的作用目的:研究金屬硫蛋白(MT)是否可以改善衣霉素(Tunicamycin,TN)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的心肌損傷,同時研究自噬與氧化應(yīng)激的關(guān)系以及在本實驗中所起的作用。
　　方

5、法:野生型小鼠(Wild-type friendly virus B,FVB)和金屬硫蛋白心肌特異性過表達(dá)小鼠(Metallothionein,MT)(雄性,5-6月),隨機(jī)分為四組:FVB、FVB+TN、MT和MT+TN。TN組腹腔注射TN(1 mg/kg/d)共2 d,48 h后,分別進(jìn)行各組超聲心動圖、單個心肌細(xì)胞收縮、舒張和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測;DCF染色檢測心肌組織ROS量;Western Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白 GRP

6、78、GADD153、eIF2α、p-eIF2α、IRE1α、p-IRE1α以及自噬相關(guān)蛋白ULK1、p-ULK1(Ser777)、Atg5、Atg7、LC3B的水平;分離小鼠心肌細(xì)胞并給予自噬抑制劑3-MA或抗氧化劑NAC,孵育2h后,檢測給藥后單個心肌細(xì)胞收縮和舒張功能。
　　結(jié)果:腹腔注射TN2 d后,超聲心動圖結(jié)果顯示,FVB+TN組的左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)較FVB空白組明顯增大

7、,左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)較FVB空白組顯著降低(p<0.05),過表達(dá)的MT可以明顯減輕TN所致的左心室收縮和舒張功能的降低(p<0.05);單個心肌細(xì)胞收縮和舒張功能以及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測顯示,TN明顯降低了 FVB小鼠單個心肌細(xì)胞收縮峰值(PS)、最大收縮速率(+dL/dt)、最大舒張速率(-dL/dt)和鈣熒光值變化量(ΔFFI),并延長了心肌細(xì)胞舒張90%時間(TR90)和鈣熒光值消退時間(Ca2+ decay rate)(p<

8、0.05),過表達(dá)MT可明顯改善上述指標(biāo)的改變,明顯減輕TN對心肌細(xì)胞收縮和舒張功能以及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的損傷作用(p<0.05);DCF染色顯示,FVB+TN組較FVB組ROS量明顯增加,過表達(dá)的MT可以顯著減少TN所致ROS量的增加(p<0.05);Western Blot結(jié)果顯示,FVB+TN組較FVB組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白GRP78、GADD153、p-eIF2α、p-IRE1ɑ以及自噬相關(guān)蛋白p-ULK1(Ser777)、Atg5

9、、Atg7、LC3B和p62水平明顯升高(p<0.05),而過表達(dá)MT可以明顯逆轉(zhuǎn)TN所致上述蛋白表達(dá)量的變化（p<0.05)。細(xì)胞給藥后,心肌細(xì)胞收縮功能顯示,FVB+TN+3MA,FVB+TN+NAC與FVB+TN組相比,兩組心肌細(xì)胞收縮峰值、最大收縮和舒張速率均明顯增加以及心肌細(xì)胞舒張90%時間明顯縮短(p<0.05),兩組上述指標(biāo)與FVB組相比無顯著性差異(p>0.05),證明自噬抑制劑3MA和抗氧化劑NAC可以恢復(fù)TN所致FV

10、B小鼠心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能損傷,即有效地抑制自噬和抗氧化,在TN所致的心肌損傷中具有保護(hù)作用。
　　實驗二凋亡的作用目的:研究金屬硫蛋白(MT)能否改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(TN誘導(dǎo))所致的心肌損傷以及對線粒體功能和凋亡信號通路的作用。
　　方法:野生型小鼠(Wild-type friendly virus B,FVB)和金屬硫蛋白心肌特異性過表達(dá)小鼠(Metallothionein,MT)(雄性,5-6月),被隨機(jī)分為四組:FV

11、B、FVB+TN、MT和MT+TN。TN組腹腔注射TN(1 mg/kg/d)共2 d,48 h后,分別進(jìn)行各組小鼠的超聲心動圖、單個心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測;同時用JC-1熒光檢測線粒體膜電位情況;檢測Caspase-3活性觀察心肌細(xì)胞凋亡情況;Western Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白 GRP78、GADD153、eIF2α、p-eIF2α、 IRE1ɑ、p-IRE1ɑ以及凋亡信號通路相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2、

12、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的水平變化。
　　結(jié)果:腹腔注射TN2 d后,超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn)FVB+TN組與FVB空白組相比,左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)顯著增大,左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)明顯降低(p<0.05),過表達(dá)的MT可以明顯減輕TN對左心室收縮和舒張功能的損傷(p<0.05);單個心肌細(xì)胞收縮和舒張功能以及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測顯示,TN明顯降低了FVB小鼠

13、單個心肌細(xì)胞收縮峰值(PS)、最大舒張速率(-dL/dt)、最大收縮速率(+dL/dt)和鈣熒光值變化量(ΔFFI),延長了單個心肌細(xì)胞舒張90%的時間(TR90)和鈣熒光值消退時間(Ca2+decay rate)(p<0.05),過表達(dá) MT可以明顯減輕 TN對心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的損傷(p<0.05);JC-1熒光檢測顯示,FVB+TN組較FVB組線粒體膜電位水平明顯降低,過表達(dá)MT明顯地緩解TN所致的線粒體膜電位水

14、平的降低(p<0.05);Western Blot結(jié)果顯示,FVB+TN組較FVB組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白GRP78、GADD153、p-eIF2α、p-IRE1ɑ以及凋亡相關(guān)蛋白 BAX、Caspase-9和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡的關(guān)鍵蛋白Caspase-12的水平明顯升高(p<0.05),過表達(dá)MT可以明顯地緩解TN所致的上述蛋白表達(dá)量的變化(p<0.05);Caspase-3活性檢測結(jié)果趨勢與Western Blot結(jié)果相同,表明TN所

15、致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起FVB組凋亡明顯增加,過表達(dá)MT顯著地減少心肌細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。
　　第二部分金屬硫蛋白對高血壓所致心肌損傷的心肌保護(hù)作用的機(jī)制研究實驗一自噬的作用目的:研究重金屬硫蛋白(MT)是否可以改善高血壓(L-NAME誘導(dǎo))所致的心肌損傷,同時研究自噬和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在其中的作用。
　　方法:野生型小鼠(Wild-type friendly virus B,FVB)和金屬硫蛋白心肌特異性過表達(dá)

16、小鼠（Metallothionein,MT)(雄性,5-6月),被隨機(jī)分為四組:FVB、FVB+L-NAME、MT和MT+L-NAME。L-NAME組在飲用水中加入L-NAME(NO合酶抑制劑,0.1g/L),對照組飲用自來水。處理14天后,分別檢測各組血壓、超聲心動圖、單個心肌細(xì)胞收縮和舒張功能以及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的檢測;進(jìn)行WGA和Masson染色檢測心肌細(xì)胞大小及心肌組織間隙纖維化程度;Western Blot檢測mTOR信號通路相關(guān)

17、分子AMPKɑ、p-AMPKɑ(Thr172)、TSC2、p-TSC2(Thr1462)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p70S6K、p-p70S6K(Ser424)以及自噬相關(guān)蛋白ULK1、p-ULK1(Ser777)、LC3B和P62的水平;隨后,在在體和細(xì)胞模型分別給予自噬抑制劑3-MA或自噬的激動劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA),檢測給藥后心肌細(xì)胞收縮和舒張功能。
　　結(jié)果:L-NAME處理14 d后

18、,FVB+L-NAME組和MT+L-NAME組,兩組血壓均較對照組明顯升高(p<0.05);超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn)FVB+L-NAME組的左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)較FVB空白組明顯增大,左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)較FVB空白組顯著降低(p<0.05),過表達(dá)MT可以明顯減輕L-NAME對左心室收縮和舒張功能的損傷(p<0.05)。單個心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測顯示,L-NAME明顯的降低

19、了 FVB小鼠單個心肌細(xì)胞收縮峰值(PS)、最大收縮速率(+dL/dt)、最大舒張速率(-dL/dt)和鈣熒光值變化量(ΔFFI),延長了舒張90%時間(TR90)和鈣熒光值消退時間(Ca2+decay rate)(p<0.05),過表達(dá)MT明顯減輕L-NAME對心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測的損傷(p<0.05)。Masson染色顯示,FVB+L-NAME組較FVB組心肌組織間隙發(fā)生明顯纖維化(p<0.05);WGA染色顯示

20、,L-NAME使FVB組小鼠細(xì)胞明顯增大(p<0.05),過表達(dá)MT可以明顯減輕L-NAME所致的心肌組織間隙的纖維化以及心肌細(xì)胞的增大(p<0.05);Western Blot結(jié)果顯示,FVB+L-NAME組較FVB組p-AMPKɑ(Thr172)、p-TSC2(Thr1462)水平明顯下降,p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6K(Ser424)水平明顯升高,同時自噬相關(guān)蛋白 p-ULK1(Ser777)、LC3B顯著降低,

21、P62明顯升高(p<0.05),過表達(dá)MT可以顯著緩解L-NAME所致的上述蛋白表達(dá)量的變化（p<0.05);體內(nèi)給藥,心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能顯示,FVB+L-NAME+3MA、MT+L-NAME+3MA兩組均明顯地降低了心肌細(xì)胞收縮峰值、最大收縮和舒張速率以及延長了舒張90%時間(p<0.05),3MA消除了MT的心肌細(xì)胞保護(hù)作用;細(xì)胞給藥,心肌細(xì)胞收縮和舒張功能顯示,FVB+L-NAME+RAPA,MT+L-NAME+RAPA兩組

22、所有指標(biāo)與空白組相比無顯著差異(p>0.05),表明RAPA恢復(fù)了 FVB小鼠心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能,即恢復(fù)自噬水平可以有效減輕L-NAME所致高血壓的心肌細(xì)胞損傷。
　　實驗二凋亡的作用目的:
　　研究在重金屬清除劑金屬硫蛋白(MT)改善高血壓(L-NAME誘導(dǎo))所致的心肌損傷中,線粒體功能及膜電位情況和凋亡信號通路在其中的作用。
　　方法:野生型小鼠(Wild-type friendly virus B,FVB)

23、和金屬硫蛋白心肌特異性過表達(dá)小鼠(Metallothionein,MT),隨機(jī)分為四組:FVB、FVB+L-NAME、MT和MT+L-NAME。L-NAME組在飲用水加入L-NAME(NO合酶抑制劑,0.1g/L),對照組飲用自來水。處理14天后,分別檢測各組血壓、超聲心動圖、單個心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測。同時用JC-1和TUNEL染色檢測線粒體膜電位以及心肌細(xì)胞凋亡情況；Western Blot 檢測凋亡信號通路相關(guān)蛋

24、白BAX、BAD、p-BAD、Bcl-2 以及 Caspase-9和Caspase-12的變化水平。
　　結(jié)果：L-NAME 處理 14 d 后，F(xiàn)VB+L-NAME 組和MT+L-NAME 組，兩組血壓均較對照組明顯升高（p<0.05）；超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn) FVB+L-NAME 組的左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）較 FVB 空白組明顯增大（p<0.05），心臟短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）較 FVB 空

25、白組顯著降低（p<0.05），過表達(dá)MT 可以明顯減輕 L-NAME 所致的左心室收縮和舒張功能損傷（p<0.05）；單個心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變檢測顯示，L-NAME 明顯降低了 FVB 組小鼠單個心肌細(xì)胞收縮峰值（PS）、最大舒張速率（-dL/dt）、最大收縮速率（+dL/dt）和鈣熒光值變化量（ΔFFI），延長了舒張 90%時間（TR90）和鈣熒光值消退時間（Ca2+decay rate）（p<0.05），過表達(dá) MT

26、顯著減輕 L-NAME所致高血壓對心肌細(xì)胞收縮、舒張功能和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的損傷（p<0.05）；JC-1熒光染色顯示，F(xiàn)VB+L-NAME組較 FVB 組線粒體膜電位水平明顯下降（p<0.05）；TUNEL 染色顯示，L-NAME 使FVB組凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多（p<0.05），過表達(dá) MT可以明顯提高 L-NAME所致的線粒體膜電位水平的下降以及減少心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量（p<0.05）；WesternBlot結(jié)果顯示，F(xiàn)VB+L-N

27、AME組較FVB組p-BAD和Bcl-2水平明顯下降，Caspase-9和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白 Caspase-12的水平明顯升高（p<0.05），BAD 蛋白表達(dá)量無明顯變化，過表達(dá)的MT可以明顯地緩解 L-NAME 所致的上述蛋白表達(dá)量的變化（p<0.05）；Caspase-3活性檢測結(jié)果趨勢與TUNEL染色和Western Blot 結(jié)果相同。該組實驗數(shù)據(jù)表明，在 L-NAME 所致的高血壓心肌損傷模型中，F(xiàn)VB組心肌細(xì)胞凋亡明顯