心肌細(xì)胞自噬在創(chuàng)傷后遲發(fā)性心臟損傷中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　 隨著社會經(jīng)濟(jì)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由交通事故、體育運(yùn)動、自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭、工程施工事故等多種原因?qū)е碌娜硇詸C(jī)械性創(chuàng)傷日益增多。機(jī)械性創(chuàng)傷已成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會問題?，F(xiàn)代社會，創(chuàng)傷的表現(xiàn)更為復(fù)雜多樣，創(chuàng)傷不僅可以引起直接的臟器損傷，還可以通過致傷因子作用于人體，造成多部位和多臟器的損傷。統(tǒng)計顯示，創(chuàng)傷傷員多為青壯年，而他們是社會財富的主要創(chuàng)造者，因而創(chuàng)傷救治具有重要的社會意義。
　　 創(chuàng)傷可以導(dǎo)致直接的心臟損

2、傷，嚴(yán)重的可以致患者死亡。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，由創(chuàng)傷所導(dǎo)致患者的直接死亡率已大大降低。然而，有臨床研究報道，一些全身機(jī)械性創(chuàng)傷患者，在創(chuàng)傷后的24小時觀察期內(nèi)，生命體征穩(wěn)定、心臟及其他臟器亦無臨床可檢測到的損傷，然而部分患者在出院后的數(shù)天乃至數(shù)周發(fā)生了心肌梗死等心臟事件。這些提示，全身機(jī)械性創(chuàng)傷不僅可以引起直接的心臟損傷，還可以引起遲發(fā)性心臟損傷。由于這類患者在臨床上容易被遺漏，且后果嚴(yán)重，所以對此類患者的關(guān)注顯得尤為重要，但是非致死性

3、創(chuàng)傷引起遲發(fā)性心臟損傷的具體機(jī)制尚不明確。
　　 研究表明，機(jī)體受到損傷后，可以引起細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境紊亂、代謝功能障礙等改變。在神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，機(jī)體會對內(nèi)環(huán)境的各種變化做出相應(yīng)的調(diào)整，進(jìn)而維持機(jī)體的自身穩(wěn)態(tài)平衡，這種反應(yīng)本質(zhì)上是機(jī)體的一種自穩(wěn)保護(hù)機(jī)制。有研究表明，自噬在維持機(jī)體的自身穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。自噬是一種保守的細(xì)胞行為，它可調(diào)控線粒體等多種細(xì)胞器的更新，利用降解產(chǎn)物提供能量并重建細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以維持代謝平衡和內(nèi)

4、環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬在應(yīng)激狀態(tài)下可以被激活，以延長細(xì)胞的壽命。然而當(dāng)機(jī)體自噬能力不足時，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體等重要細(xì)胞器清除障礙，進(jìn)而引起重要臟器的損傷。
　　 自噬維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的一個重要機(jī)制是清除細(xì)胞內(nèi)損傷的線粒體。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場所，線粒體對機(jī)體各種損傷最為敏感，當(dāng)損傷的線粒體沒有被及時有效的清除，進(jìn)而會引起組織或器官功能損傷。自噬在機(jī)體損傷的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，那么，在全身性非致死性機(jī)械性創(chuàng)傷后，心肌白噬水平

5、是否發(fā)生了改變？如果有改變這一改變對創(chuàng)傷后的遲發(fā)型心臟損傷有何意義是本課題關(guān)注的重要內(nèi)容。
　　 本研究將采用離體、在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃退幚韺W(xué)藥物干預(yù)等方法，探尋創(chuàng)傷后心臟功能損傷的原因及其可能機(jī)制，為尋找甲.期防治創(chuàng)傷后多器官功能衰竭的最佳方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:
　　 1觀察非致死性機(jī)械性創(chuàng)傷后心肌組織自噬的改變。
　　 2從在體及離體水平明確心肌自噬的改變在非致死性創(chuàng)傷后遲發(fā)性心臟損傷中的作用。<

6、br>　　 3尋找在非致死性創(chuàng)傷致遲發(fā)性心臟損傷過程中可能發(fā)揮作用的血清蛋白。
　　 材料與方法:
　　 1材料
　　 1.1實(shí)驗(yàn)動物
　　 健康雄性Wistar大鼠，體重180～220g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物的使用遵循中華人民共和國衛(wèi)生部令（第55號）——醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則。
　　 1.2細(xì)胞株
　　 H9c2(2-1)心肌細(xì)胞株:購自中科院上海細(xì)胞庫。

7、>　　 2實(shí)驗(yàn)分組
　　 2.1在體實(shí)驗(yàn)分組
　　 2.1.1創(chuàng)傷組(Trauma):大鼠麻醉后，放入直徑30.5cm的Noble-Collip鼓中，以40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動5min;
　　 2.1.2偽創(chuàng)傷組(Sham):將麻醉后大鼠用膠帶黏貼固定于創(chuàng)傷儀中，只隨創(chuàng)傷儀轉(zhuǎn)動而不由高處跌落;
　　 2.1.3自噬激動劑+創(chuàng)傷組(Trauma+RAPA):創(chuàng)傷前30min給予自噬的激動劑Rapamyci

8、n(RAPA)，8mg/kg，摔傷過程同上。
　　 2.2離體實(shí)驗(yàn)分組
　　 2.2.1正常細(xì)胞組:給予正常的DMEM培養(yǎng)基及10％的胎牛血清，置丁5‰CO2孵箱培養(yǎng);
　　 2.2.2干預(yù)組:給予正常的DMEM培養(yǎng)基，分別用創(chuàng)傷后1h、3h、6h、12h、24h15％的大鼠血清取代胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng);
　　 2.2.3SiRNA組:導(dǎo)入SiRNA質(zhì)粒，沉默H9c2(2-1)心肌細(xì)胞白噬基因Beclin

9、1，用創(chuàng)傷后1h、3h、6h、12h、24h15％的大鼠血清取代胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 3方法
　　 3.1機(jī)械創(chuàng)傷模型標(biāo)本的留取
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動脈取血，分別取偽創(chuàng)傷組及創(chuàng)傷后1h、3h、6h、12h、24h大鼠的動脈血:取血后，留取各組人鼠心臟標(biāo)本待測。
　　 3.2H9c2(2-1)細(xì)胞株標(biāo)本的留取
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留細(xì)胞培養(yǎng)的上清待用;留取上清后，按實(shí)驗(yàn)要求將各組細(xì)胞標(biāo)本裂解

10、后待測。
　　 3.3檢測指標(biāo)的測定
　　 3.3.1大鼠心電圖(ECG)、平均動脈壓(MABP)及在體心功能的檢測;
　　 3.3.2大鼠離體心功能的檢測;
　　 3.3.3大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)及熒光蛋白表達(dá)檢測（HE染色、免疫熒光）;
　　 3.3.4血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白(cTnI)檢測（ELISA法）;
　　 3.3.5血清甲狀腺激素[游離三碘甲腺原氨酸(FT3)，

11、游離甲狀腺素(FT4)，促甲狀腺激素(TSH)]檢測（放射免疫法）;
　　 3.3.6心肌組織LC3Ⅱ、Beclin1的蛋白含量測定(Westemblot);
　　 3.3.7心肌組織LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA含量測定(real-timePCR);
　　 3.3.8線粒體膜電位檢測（JC-1法）;
　　 3.3.999mTc-MIBI核素心肌顯像線粒體功能的檢測;
　　 3.3.10細(xì)胞計

12、數(shù)Kit-8檢測創(chuàng)傷血清對H9c2(2-1)細(xì)胞存活的影響;
　　 3.3.11細(xì)胞培養(yǎng)上清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量的測定（ELISA法）;
　　 3.3.12心肌細(xì)胞LC311，Beclin1的蛋白含量測定(Westernblot);
　　 3.3.13心肌細(xì)胞LC311、Beclin1的mRNA含量測定(real-timePCR);
　　 3.3.14shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

13、;
　　 3.3.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選;
　　 3.3.16細(xì)胞因子蛋白芯片的檢測;
　　 3.3.17血清白介素1β(1L-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、中性粒細(xì)胞趨化因子3（CINC-3）及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)檢測（ELISA法）;
　　 結(jié)果:
　　 1非致死性機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷模型建立成功
　　 l.1機(jī)械性創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠呼吸、心率、心電圖等

14、一般情況正常
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24h內(nèi)各時間點(diǎn)ECGT波及ST段未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)。與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24h內(nèi)各時間點(diǎn)大鼠心率及呼吸頻率未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)。麻醉大鼠一般在創(chuàng)傷后1.5h左右自然蘇醒，24h內(nèi)大鼠生存率為100％。
　　 1.2機(jī)械性創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠平均動脈壓(MABP)、在體心功能及心肌組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯改變
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（103.20±12.42

15、mmHg），創(chuàng)傷后即刻MABP出現(xiàn)明顯降低（79.92±12.08mmHg）(P＜0.01)，約1h左右恢復(fù)正常后，24h內(nèi)未再次出現(xiàn)異常。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠LVDP、+dP/dTmax和-dP/dTmax均無明顯差異(P＞0.05)。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠心肌組織的結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯改變，無炎性細(xì)胞浸潤。
　　 1.3機(jī)械性創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB

16、)及肌鈣蛋白(cTn1)無明顯改變
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠CK-MB及cTnI未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05）。
　　 1.4機(jī)械性創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠血清中甲狀腺激素(FT3、FT4、TSH)未出現(xiàn)明顯改變
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24h內(nèi)人鼠FT3、FT4及TSH未出現(xiàn)明顯改變(P＞0.05)。
　　 1.5機(jī)械創(chuàng)傷后24h大鼠離體心功能降低
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后24

17、h內(nèi)大鼠LVDP、+dP/dTmax和-dP/dTmax約顯著下降[LVDP:(87.5±11.6)mmHg,vs.(103.0±8.9)mmHg,P＜0.05;+dP/dTmax:(2060.0±266.6)mmHg/sec,vs.(2830.16±395.3)mmHg/sec,P＜O.O1;-dP/dTmax:(-1666.5±243.4)mmHg/secvs.（-2048.3±282.9)mmHg/sec,P＜0.05].

18、　　 2心肌組織自噬水平下降可能是創(chuàng)傷后心功能損傷的重要原因
　　 2.1機(jī)械性創(chuàng)傷后24h內(nèi)大鼠心肌組織自噬水平降低
　　 2.1.1創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)Beclin1蛋白水平和mRNA水平的改變
　　 與偽創(chuàng)傷組（0.94±0.23）相比，創(chuàng)傷后1hBeclin1蛋白表達(dá)下降（0.59±0.10，P＜0.05），至創(chuàng)傷后3h降至最低（0.30±0.15，P＜O.O1），之后逐漸恢復(fù)，創(chuàng)傷后24h恢復(fù)至正常水平（

19、1.04±0.18，P＞0.05）。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.00±0.15），創(chuàng)傷后1hBeclin1mRNA水平開始下降（0.49±0.11，P＜0.05）,3h降至最低（0.32±0.22，P＜O.Ol），之后逐漸恢復(fù)，至24h恢復(fù)至正常水平(1.17±0.56，P＞0.05)。
　　 2.1.2創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)LC3Ⅱ蛋白水平和mRNA水平的改變
　　 與偽創(chuàng)傷組（1.01+0.12）相比，創(chuàng)傷后1hL

20、C3Ⅱ蛋白表達(dá)下降（0.62±0.16，P＜0.05），至創(chuàng)傷后6h降至最低（0.30±0.14，P＜O.01），之后逐漸恢復(fù)，創(chuàng)傷后24h恢復(fù)至正常水平（1.08±0.32，P＞0.05）。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比(0.98±0.13)，創(chuàng)傷后1hLC3ⅡmRNA表達(dá)下降（0.46±0.16，P＜0.05），
　　 6h降至最低（0.34±0.15，P＜0.01），之后逐漸恢復(fù)，至24h恢復(fù)至正常水平（0.98±0.40

21、，P＞0.05）。
　　 2.2升高自噬水平可以改善創(chuàng)傷后離體心功能的異常
　　 2.2.1自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)可以上調(diào)自噬
　　 2.2.1.1給予RAPA后，Beclin1蛋白水平和mRNA水平上調(diào)
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.14±0.33），創(chuàng)傷后Beclin1蛋白水平顯著下降(0.52±0.15，P＜0.05vs.Sham)，創(chuàng)傷前30min給予RAPA可以顯著上調(diào)創(chuàng)

22、傷后Beclin1蛋白水平(1.18±0.26，P＜0.05vs.saline)。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.18±0.29），創(chuàng)傷后Beclin1mRNA水平顯著下降(0.74±0.15，P＜0.05)，創(chuàng)傷前30min給予RAPA可以顯著上調(diào)創(chuàng)傷后Beclin1mRNA水平(1.03±0.26，P＜0.05)。
　　 2.2.1.2給予RAPA后，LC3Ⅱ蛋白水平和mRNA水平上調(diào)
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.

23、28±0.29），創(chuàng)傷后LC3Ⅱ蛋白水平顯著下降（0.69±0.15，P＜0.05），創(chuàng)傷前30min給予RAPA可以顯著，卜調(diào)創(chuàng)傷后LC3Ⅱ蛋白水平（1.13±0.26，P＜0.05）。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.00±0.28），創(chuàng)傷后LC3ⅡmRNA水平顯著下降（0.55±0.13，P＜O.01），創(chuàng)傷前30min給予RAPA可以顯著上調(diào)創(chuàng)傷后LC3ⅡmRNA水平（0.86±0.31，P＜0.05）。
　　 2.2

24、.1.3給予RAPA后，Beclin1和LC3Ⅱ免疫熒光聚點(diǎn)增多
　　 采用激光共聚焦技術(shù)觀察LC3Ⅱ及Beclin1的熒光表達(dá)。與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后心肌組織LC3Ⅱ及Beclin1蛋白聚點(diǎn)減少，提示其表達(dá)降低(P＜0.05)，而給予RAPA后，LC3Ⅱ及Beclin1的表達(dá)升高，與創(chuàng)傷組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 2.2.2上調(diào)自噬可以改善創(chuàng)傷后24h離體心功能異常
　　 創(chuàng)傷前30min給予

25、RAPA后，與創(chuàng)傷組相比，治療組離體心功能指標(biāo)LVDP、+dP/dTmax和-dP/dTmax均顯著回升[LVDP:（94.3±9.8）mmHg，vs.（87.5±11.6）mmHg，P＜0.05;+dP/dTmax:(2663.0±332.2)mmHg/sec,vs.(2060.0±266.6)mmHg/sec,P＜0.01;-dP/dTmax:(-1914.8±215)mmHg/secvs.(-1666.5±243.4)mmHg/s

26、ec,P　　 3上調(diào)自噬可以改善創(chuàng)傷后心肌線粒體功能障礙
　　 3.1創(chuàng)傷后大鼠心肌組織線粒體膜電位下降
　　 采用JC-1法檢測線粒體膜電位。當(dāng)線粒體膜電位正常時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光;當(dāng)線粒體膜電位降低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，以單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示，偽創(chuàng)傷組線粒體膜電位顯示紅色，而創(chuàng)傷組線粒體膜電位為綠色。
　　 3.2上

27、調(diào)自噬可以改善創(chuàng)傷后心肌線粒體功能障礙
　　 采用核素99mTc-MIBI檢測心肌線粒體功能。結(jié)果顯示，與偽創(chuàng)傷組相比（1.96±0.13），創(chuàng)傷后心肌線粒體對99mTc-MIBI的攝取降低（1.68±0.19，P＜0.05），而創(chuàng)傷前給與RAPA后，心肌對99mTc-MIBI的攝取顯著提高（1.94±0.20，P＜0.01）。
　　 4自噬改變在創(chuàng)傷后血清導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷中的意義
　　 4.1創(chuàng)傷后血清引起心肌

28、細(xì)胞損傷模型建立
　　 用正常胎牛血清（control組）培養(yǎng)H9c2細(xì)胞3h、6h、12h、24h及48h后，各時間點(diǎn)細(xì)胞的存活率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;用偽創(chuàng)傷組大鼠血清（Sham組）培養(yǎng)H9c2細(xì)胞3h、6h、12h、24h及48h后各時間點(diǎn)細(xì)胞的存活率無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05);與control組相比，用Sham組大鼠血清培養(yǎng)細(xì)胞后存活率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;與Sham組相比，將創(chuàng)傷后3h血清加入H9c2

29、細(xì)胞，培養(yǎng)3h后細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05)，培養(yǎng)12h降至最低（P＜0.01）;將創(chuàng)傷后6h血清加入H9c2細(xì)胞，與Sham組相比，培養(yǎng)3h細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05)，培養(yǎng)12h下降最為明顯(P＜0.01)。
　　 4.2創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)血清培養(yǎng)H9c2細(xì)胞12h后培養(yǎng)液中CK及LDH變化
　　 與偽創(chuàng)傷組[（138.33±17.18）U/L]相比，創(chuàng)傷后12h血清培養(yǎng)細(xì)胞后培養(yǎng)液中CK含量明顯升高[（1

30、60.16±18.85）U/L，P＜0.05]。與偽創(chuàng)傷組[（112.40±12.13）U/L]相比，創(chuàng)傷后12h血清培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量明顯升高[（141.80±15.19）U/L，P＜0.05]。
　　 4.3創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)血清培養(yǎng)H9c2細(xì)胞后自噬的變化
　　 4.3.1Beclin1蛋白水平和mRNA表達(dá)升高
　　 與偽創(chuàng)傷組（1.08±0.32）相比，創(chuàng)傷后3h血清培養(yǎng)細(xì)胞后，Beclfn1蛋

31、白水平升至最高（1.76±0.55，P＜0.01vs.Sham），之后逐漸恢復(fù)，創(chuàng)傷后24h恢復(fù)至正常水平(1.18±0.28，P＞0.05)。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.00±0.54），創(chuàng)傷后3h血清培養(yǎng)細(xì)胞12h后，Beclin1mRNA升至最高（1.63±0.24，P＜O.O1），之后逐漸恢復(fù)。
　　 4.3.2LC3Ⅱ蛋白水平和mRNA表達(dá)升高
　　 與偽創(chuàng)傷組（1.11±0.27）相比，創(chuàng)傷后6h血清

32、培養(yǎng)后LC3Ⅱ蛋白水平升至最高（1.82±0.64，P＜0.01），之后逐漸恢復(fù)，創(chuàng)傷后24h血清培養(yǎng)l2h后恢復(fù)至正常水平（1.25±0.46，P＞0.05）。
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.01±0.17），創(chuàng)傷后12h血清培養(yǎng)細(xì)胞12h后LC3ⅡmRNA水平升至最高（1.85±0.43，P＜0.01），之后逐漸恢復(fù)，創(chuàng)傷后24h血清培養(yǎng)12h后恢復(fù)至正常水平（1.08±0.18，P＞0.05）。
　　 4.4將pSUP

33、ER-Beclin1轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞后自噬的變化
　　 4.4.1Beclinl蛋白及mRNA含量的變化
　　 與正常細(xì)胞相比（1.15±0.20），將質(zhì)粒pSUPER-Beclin1導(dǎo)入H9c2后，Beclin1蛋白水平明顯下降（0.58±0.17，P＜0.05）;而導(dǎo)入空質(zhì)粒pSUPER-non后，Beclin1蛋白水平基本沒有變化（1.32±0.24，P＞0.05）。
　　 與正常細(xì)胞相比（0.95±0.2

34、4），將質(zhì)粒pSUPER-Beclin1導(dǎo)入H9c2后，Beclin1mRNA水平明顯下降（0.39±0.08，P＜0.05）;而導(dǎo)入空質(zhì)粒pSUPER-non后，BeclinlmRNA水平基本沒有變化（0.89±0.19，P＞0.05）。
　　 4.4.2LC3Ⅱ蛋白及mRNA含量的變化
　　 與正常細(xì)胞相比（1.08±0.26），將質(zhì)粒pSUPER-Beclin1導(dǎo)入H9c2后，LC3Ⅱ蛋白水平明顯下降（0.56±0

35、.10，P＜0.05）;而導(dǎo)入空質(zhì)粒pSUPER-non后，LC3Ⅱ蛋白水平基本沒有變化（0.97±0.25，P＞0.05）。
　　 與正常細(xì)胞相比（0.93±0.20），將質(zhì)粒pSUPER-Beclin1導(dǎo)入H9c2后，LC3ⅡmRNA水平明顯下降（0.48±0.08，P＜0.05）;而導(dǎo)入空質(zhì)粒pSUPER-non后，LC3ⅡmRNA水平基本沒有變化（0.97±0.24，P＞0.05）。
　　 4.5創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)

36、血清培養(yǎng)轉(zhuǎn)染pSUPER-Beclin1的H9c2細(xì)胞12h后，細(xì)胞出現(xiàn)損傷
　　 4.5.1細(xì)胞存活率的降低
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（104.90±16.92），加入創(chuàng)傷后6h的血清后，H9c2細(xì)胞存活率降到最低(51.30±10.70,P＜0.01).
　　 4.5.2細(xì)胞培養(yǎng)液中CK及LDH升高
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（143.00±15.32）U/L，加入創(chuàng)傷后12h的血清CK含量升至最高[(243.

37、50±35.05)U/L,P＜O.O1].
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（112.40±12.03）U/L，加入創(chuàng)傷后12h的血清LDH含量升至最高[(201.80±16.30)U/L,P＜O.01]。
　　 5創(chuàng)傷后血清中與應(yīng)激有關(guān)的細(xì)胞因子蛋白芯片篩查
　　 5.1創(chuàng)傷后血清中5種細(xì)胞因子升高
　　 創(chuàng)傷后1h血清巾，IL-1bate、TNF-alpha、IFN-gamma、CINC-3、CNTF均顯著升高，

38、與偽創(chuàng)傷組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 5.2創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)血清中TNF-α含量升高
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（66.57±14.18）pg/ml，創(chuàng)傷后即刻TNF-a含量升至最高(178.00±39.81，P＜0.01)pg/ml。此后逐漸回落，至創(chuàng)傷后24h基本降至正常水平[（77.33±19.45）pg/ml]，P＞0.05。
　　 5.3創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)血清中IL-1β含量升高
　　 與

39、偽創(chuàng)傷組相比（29.48±11.07）pg/ml，創(chuàng)傷后1h血清中含量升至最高[（29.48±11.07）pg/ml，P＜0.01]，之后開始回落，至創(chuàng)傷后6h血清中含量基本恢復(fù)正常水平[（27.30±9.72）pg/ml,P＞0.05]。
　　 5.4創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)血清中IFN-γ含量升高
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（1.12±0.14）pg/ml，創(chuàng)傷后6h血清中含量升至最高[（19.87±1.67）pg/ml，P＜0.

40、01】，之后開始回落，但至創(chuàng)傷后24h血清巾含量仍維持在較高水平。
　　 5.5創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)血清中CINC-3含量升高
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（67.62±8.57）pg/ml，創(chuàng)傷后3h血清中CINC-3含量升至最高[（375.10±52.13）pg/ml，P＜O.O1]，之后開始回落，創(chuàng)傷后12h血清中含量基本降至正常水平[（59.31±12.61）pg/ml，P＞0.05]。
　　 5.6創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)

41、血清中CNTF含量升高
　　 與偽創(chuàng)傷組相比（0.16±0.03）pg/ml，創(chuàng)傷后即刻即出現(xiàn)明顯升高（1.22±0.22，P＜0.01）pg/ml，至創(chuàng)傷后6h血清中CNTF含量升至最高[（3.29±0.84）pg/ml，P＜O.O1]，之后開始回落，但至創(chuàng)傷后24h血清中CNTF含量仍維持在較高水平[（1.16±0.20）pg/ml，P＜0.01]。
　　 結(jié)論:
　　 1.全身性非致死性機(jī)械性創(chuàng)傷可以導(dǎo)致心