自噬在布比卡因肌毒性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：局部麻醉藥(local anaesthetics，LAs)是臨床實(shí)施局部麻醉和鎮(zhèn)痛的常用藥。然而，越來(lái)越多的報(bào)道顯示，LAs在減輕患者術(shù)后疼痛、促進(jìn)機(jī)體功能恢復(fù)的同時(shí)，還存在潛在的骨骼肌毒性。局部持續(xù)注射LAs可引起周?chē)趋兰p傷，包括醫(yī)源性肌肉疼痛、功能障礙和肌肉變性。雖然對(duì)LAs潛在肌毒性的研究已有50多年，但LAs導(dǎo)致骨骼肌毒性的具體機(jī)制仍未被全面了解。因此，深入探討LAs引起肌毒性的具體機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)防治LAs副作用的新方

2、法。自噬是一種進(jìn)化上高度保守的的代謝過(guò)程，它可將細(xì)胞內(nèi)成分如受損的蛋白和細(xì)胞器，通過(guò)溶酶體依賴途徑降解。所以自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。哺乳動(dòng)物中的自噬可分為三種:巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬（即本文所指的自噬）可分為自噬體形成、自噬體成熟、自噬體降解三個(gè)階段。自噬體形成階段指膜結(jié)構(gòu)包裹需要降解細(xì)胞成分;自噬體成熟和降解階段指自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，繼而降解其內(nèi)容物。有研究表明阻斷自噬流可直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡或增加

3、細(xì)胞對(duì)損傷性刺激的敏感性。
　　目的：探討自噬在局麻藥布比卡因肌毒性中的作用及機(jī)制。
　　方法：①采用MTT法測(cè)定不同濃度布比卡因?qū)?xì)胞存活的影響，選擇合適的布比卡因濃度作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｍㄟ^(guò)LIVE/DEAD染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率。于相差倒置顯微鏡(200×)下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)改變。伊紅染色觀察小鼠腓腸肌組織學(xué)變化。②共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-LC3融合蛋白表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白水平，透

4、射電鏡下觀察自噬體結(jié)構(gòu)。③LysoTracker Red DND-99(溶酶體探針)染色檢測(cè)溶酶體數(shù)量，LysoSensorYellow/Blue DND-160(溶酶體染料)染色檢測(cè)溶酶體腔PH值的變化，Cathepsin-B活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)溶酶體酶Cathepsin-B的活性。Western blot法檢測(cè)LAMP-1蛋白水平。④采用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理后，Western blot法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和p62蛋白水平，

5、采用EGFP-LC3和Lyso Tracker熒光雙染檢測(cè) EGFP-LC3和溶酶體共域化程度，通過(guò)LIVE/DEAD染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率。于相差倒置顯微鏡(200×)下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)改變。⑤Atg5 siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理后，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)Atg5 mRNA水平，采用Western blot法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和p62蛋白水平，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。⑥采用Western blot法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白

6、LC3-Ⅱ和p62蛋白水平，采用EGFP-LC3和Lyso Tracker熒光雙染檢測(cè)EGFP-LC3和溶酶體共域化程度，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。通過(guò)LIVE/DEAD染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率。于相差倒置顯微鏡(200×)下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)改變。
　　結(jié)果：⑴終濃度為100μM、300μM、600μM、900μM、1200μM的布比卡因作用24hr后，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，100μM對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯的抑制作用，然而后四種

7、濃度的細(xì)胞增殖抑制率分別為16.0％，49.0％，65.0％和76.8％，且抑制率隨布比卡因濃度的增加而逐漸增加(P＜0.01)。⑵布比卡因(600μM)處理24hr后，于相差倒置顯微鏡(200×)下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)改變。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，布比卡因組細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間間隙變大，細(xì)胞形態(tài)完整性消失。⑶布比卡因(600μM)作用36hr后，用LIVE/DEAD染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，布比卡因組死細(xì)胞數(shù)占總細(xì)

8、胞數(shù)的百分比增加了18倍(P＜0.01)。⑷0.5％，20μl的布比卡因注射小鼠腓腸肌，72hr后收集骨骼肌組織，經(jīng)石蠟包埋切片后，進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示:對(duì)照組（生理鹽水組）僅有輕微的水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。布比卡因組肌細(xì)胞間質(zhì)水腫顯著，肌纖維溶解斷裂，細(xì)胞核消失，組織間質(zhì)中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。⑸EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，布比卡因(600μM)作用6hr。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，自噬體的標(biāo)志物EGFP-LC3融合蛋白表達(dá)增加轉(zhuǎn)位至自噬

9、體膜增多，在共聚焦顯微鏡下形成的明亮的綠色熒光亮點(diǎn)數(shù)量是對(duì)照組的34倍(P＜0.01)。⑹布比卡因(600μM)作用6hr后，Western blot法檢測(cè)顯示:與對(duì)照組相比，布比卡因組胞漿型LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3-Ⅱ(自噬標(biāo)志蛋白)增多，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值是對(duì)照組的5.5倍(P＜0.01)。⑺0.5％，20μl的布比卡因注射小鼠腓腸肌18hr后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組（生理鹽水組）相比，布比卡因組胞漿型L

10、C3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3-Ⅱ(自噬標(biāo)志蛋白)增多，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值是對(duì)照組的4.3倍(P＜0.01)。⑻布比卡因(600μM)作用6hr后，透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，布比卡因組內(nèi)含各種多余或衰老細(xì)胞器的、成雙層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)的自噬體增多，數(shù)量是對(duì)照組的5.6倍(P＜0.01）。⑼0.5％，20μl的布比卡因注射小鼠腓腸肌18hr后，透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn):對(duì)照組（生理鹽水組）肌組織中幾乎未見(jiàn)自噬體樣微結(jié)構(gòu)，而布比卡因組肌組織內(nèi)含各

11、種多余或衰老細(xì)胞器的、成雙層膜液泡狀結(jié)構(gòu)的自噬體明顯增多。⑽布比卡因(600μM)作用6hr后，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):布比卡因組p-Akt，p-p70S6K和p-mTOR蛋白水平較對(duì)照組相比明顯降低46.9％，36.4％和46.6％(P＜0.01)。⑾布比卡因(600μM)作用6hr后，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):布比卡因組p62蛋白水平較對(duì)照組相比明顯增加29.1％(P＜0.01)。⑿0.5％，20μl的布比卡因

12、注射小鼠腓腸肌18hr后，收集肌組織，應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)p62蛋白水平。結(jié)果顯示:布比卡因組處理18hr后，與生理鹽水組相比，布比卡因組p62蛋白水平明顯增加91.6％(P＜0.01)。⒀布比卡因(600μM)作用6hr后，LysoTracker Red DND-99(溶酶體探針)染色發(fā)現(xiàn):布比卡因組溶酶體數(shù)量較對(duì)照組相比增加15.2％(P＜0.01)。⒁布比卡因(600μM)作用6hr后，LysoSensor Yello

13、w/Blue DND-160(溶酶體染料)染色發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，陰性參照氯喹組，酸性溶酶體腔被堿化，溶酶體功能障礙，代表活性溶酶體的明亮的綠色熒光亮點(diǎn)幾乎沒(méi)有。而布比卡因組的明亮的綠色熒光亮點(diǎn)數(shù)較對(duì)照組相比無(wú)減少。⒂布比卡因(600μM)作用6hr后，Cathepsin-B活性檢測(cè)試劑盒染色發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，布比卡因組的cathepsin B活性增高23.7％(P＜0.01)。⒃布比卡因(600μM)作用6hr后，Western b

14、lot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):布比卡因組LAMP-1蛋白水平較對(duì)照組相比明顯增加34.6％(P＜0.01)。⒄布比卡因(600μM)作用6hr后，采用EGFP-LC3和Lyso Tracker熒光雙染發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，布比卡因組EGFP-LC3和溶酶體共域化（黃色熒光）比例顯著減少67.0％(P＜0.01)。⒅雷帕霉素(500nM)預(yù)處理30min后，加入布比卡因(600μM)作用6hr，Westernblot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與布比卡因組比較，雷帕霉

15、素+布比卡因組的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加60.8％(P＜0.01)，雷帕霉素+布比卡因組的p62蛋白水平降低57.6％(P＜0.01)。結(jié)果同時(shí)顯示，與對(duì)照組比較，雷帕霉素組的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加，p62蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。⒆雷帕霉素(500nM)預(yù)處理30min后，加入布比卡因(600μM)作用6hr，應(yīng)用EGFP-LC3和Lyso Tracker熒光雙染發(fā)現(xiàn):與布比卡因組比較，雷帕霉素+布比卡因組的EGFP-LC3

16、和溶酶體共域化部分（黃色熒光）所占比例顯著增加312.5％(P＜0.01)。⒇雷帕霉素(500nM)預(yù)處理30min后，加入布比卡因(600μM)作用24hr，相差倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):雷帕霉素+布比卡因組顯著減輕布比卡因誘導(dǎo)的C2c12細(xì)胞形態(tài)損傷，布比卡因未處理前，細(xì)胞呈規(guī)則的梭形或多邊形，有立體感。布比卡因處理后，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間間隙變大，細(xì)胞形態(tài)完整性消失，而雷帕霉素+布比卡因組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化較布比卡因組顯著減輕。雷帕霉素單獨(dú)