生物鐘基因Bmal1調(diào)控自噬在高糖誘導(dǎo)心肌損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、糖尿病心肌病是糖尿病引起心肌代謝紊亂和心臟微血管病變所致的心肌廣泛局灶性損傷壞死，是糖尿病患者高心力衰竭發(fā)生率和高死亡率的主要原因，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。高血糖是糖尿病心肌病的獨立危險因素，高血糖的持續(xù)時間和嚴(yán)重程度與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但目前還缺乏有效的措施防止人類高糖心肌損傷的發(fā)生發(fā)展。這表明高糖導(dǎo)致心臟毒性仍有其他尚未闡明的發(fā)病機(jī)制。因此進(jìn)一步深入探討其發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的靶向治療手段，已成為當(dāng)前糖尿病和心臟病學(xué)界亟待

2、解決的問題。
　　自噬是真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種降解細(xì)胞中損傷或衰老細(xì)胞器及生物大分子的分解代謝過程。長期以來，自噬被當(dāng)做是一種在饑餓和壓力等環(huán)境中維持能量穩(wěn)態(tài)的生存保護(hù)機(jī)制。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬作為一把雙刃劍，它對細(xì)胞既可以起保護(hù)作用也可以造成細(xì)胞損傷，這取決于細(xì)胞所處的環(huán)境，刺激的強(qiáng)度和性質(zhì)，以及自噬發(fā)生的水平。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，自噬在糖尿病心肌病發(fā)生和發(fā)展過程中也扮演著重要角色。但到目前為止，在1型和2型糖尿病整體水平由于自噬

3、受到更加復(fù)雜的代謝變化和信號調(diào)節(jié)，自噬的改變和意義還存在爭議。目前單純針對離體高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞自噬的研究有可能為我們找到糖尿病心肌病新靶點提供線索。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，人或動物的晝夜生物節(jié)律被破壞是許多疾病如肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等的危險因素。生物鐘與地球晝夜循環(huán)相適應(yīng)，是一種生物體內(nèi)進(jìn)化保守的基本機(jī)制。哺乳動物晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持與生物鐘基因的周期性表達(dá)有關(guān)，生物節(jié)律是由一組生物鐘基因Bmal1、Clock、Cry和P

4、er等調(diào)控。在人體的心臟內(nèi)生物鐘基因呈明顯的晝夜節(jié)律性，但波動性最明顯的是Brain and muscle Arnt-like1(Bmal1)基因。在生物鐘基因形成的自激正負(fù)轉(zhuǎn)錄反饋環(huán)路中Bmal1基因是最主要的啟動因子，是中樞和外周節(jié)律起搏點的關(guān)鍵組件。Bmal1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出完全消失的生物節(jié)律性。在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病模型中，可發(fā)現(xiàn)生物鐘活性的異常。敲除Bmal1基因可誘發(fā)包括糖異生、高脂血癥、糖耐量減低等多種代謝異常。因此生

5、物鐘基因Bmal1及其靶基因表達(dá)異?？赡艹蔀樘悄虿⌒募p傷的新機(jī)制。
　　本研究通過制備高糖新生大鼠原代心肌細(xì)胞損傷模型，應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，探究生物鐘基因Bmal1表達(dá)異常對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用及分子生物學(xué)機(jī)制。本研究主要包括以下四個部分：
　　第一部分：高糖刺激對心肌細(xì)胞的作用及其對心肌細(xì)胞自噬的影響
　　目的：
　　1.構(gòu)建高糖條件對新生大鼠原代心肌細(xì)胞的損傷模型。
　　2.觀察高

6、糖條件對心肌細(xì)胞的作用。
　　3.觀察高糖條件對心肌細(xì)胞自噬活性的影響，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　取出生2-3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，分為兩組：（1）正常葡萄糖（5.5mM）對照組；（2）高糖(25mM)組。應(yīng)用Live/Dead染色觀察兩組細(xì)胞死亡情況，通過TUNEL染色和Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、CARP分析兩組細(xì)胞凋亡發(fā)生情況；并通過Western bl

7、ot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12–5、P62分析心肌細(xì)胞自噬情況，LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12–5蛋白與自噬水平正相關(guān)， p62蛋白與自噬水平負(fù)相關(guān)，并進(jìn)一步通過應(yīng)用溶酶體抑制劑巴弗洛霉素（bafilomycin A1，BAF），以ΔLC3-II表示自噬流水平，來更準(zhǔn)確的評估兩組的自噬活性。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立高糖條件下新生大鼠原代心肌細(xì)胞損傷模型。
　　2

8、.與正常對照組相比，高糖組死亡和凋亡的心肌細(xì)胞明顯增多。
　　3.高糖組心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC-I、BECN1、ATG12–5水平明顯降低，P62水平明顯升高，表明高糖組心肌細(xì)胞自噬水平明顯降低。此外，高糖組的ΔLC3-II水平明顯低于正常對照組，更進(jìn)一步表明高糖條件下自噬受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1.高糖可誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞損傷。
　　2.高糖條件下新生大鼠心肌細(xì)胞的自噬受到抑制。
　

9、　第二部分：生物鐘基因Bmal1表達(dá)變化對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響
　　目的：
　　1.觀察大鼠心肌細(xì)胞 Bmal1基因過表達(dá)是否影響及如何影響正常葡萄糖或高糖條件下的心肌細(xì)胞損傷。
　　2.觀察大鼠心肌細(xì)胞 Bmal1基因低表達(dá)是否影響及如何影響正常葡萄糖或高糖條件下的心肌細(xì)胞損傷。
　　方法：
　　通過Bmal1 cDNA或sh RNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，造成心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)或低表達(dá)，分別以p

10、 cDNA或SC shRNA作為對照組，將轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞分別置于高糖和正常葡萄糖環(huán)境中培養(yǎng)。具體分組如下：（1）Bmal1 cDNA+高糖處理組；（2）p cDNA+高糖處理組；（3）Bmal1 cDNA+正常糖處理組；（4）p cDNA+正常糖處理組；（5）Bmal1 shRNA+高糖處理組；（6）SC shRNA+高糖處理組；（7）Bmal1 shRNA+正常糖處理組；（8）SC shRNA+正常糖處理組。應(yīng)用Live/Dead染

11、色觀察各組細(xì)胞死亡情況，通過TUNEL染色和Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、CARP分析各組細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。
　　結(jié)果：
　　1.與p cDNA對照組相比，新生大鼠心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)對正常葡萄糖條件下心肌細(xì)胞的存活率、凋亡沒有明顯差別，但在高糖環(huán)境中Bmal1基因過表達(dá)明顯降低心肌細(xì)胞死亡和凋亡。
　　2.與SC shRNA對照組相比，新生大鼠心肌細(xì)胞Bmal1基因低表達(dá)對正常葡萄

12、糖條件下心肌細(xì)胞的死亡和凋亡沒有明顯影響，但在高糖環(huán)境中Bmal1基因低表達(dá)明顯加重心肌細(xì)胞死亡和凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.Bmal1基因低表達(dá)或過表達(dá)對正常糖環(huán)境中的新生大鼠心肌細(xì)胞的死亡和凋亡無明顯影響。
　　2.Bmal1基因過表達(dá)可顯著減少高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞損傷， Bmal1基因低表達(dá)可明顯加重高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞損傷。
　　第三部分：生物鐘基因Bmal1通過調(diào)控自噬在高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中

13、發(fā)揮作用
　　目的：
　　1.觀察大鼠心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)是否影響及如何影響正常葡萄糖或高糖條件下的心肌細(xì)胞的自噬活性。
　　2.觀察大鼠心肌細(xì)胞Bmal1基因低表達(dá)是否影響及如何影響正常葡萄糖或高糖條件下的心肌細(xì)胞的自噬活性。
　　3.在觀察到新生大鼠在高糖環(huán)境中Baml1基因過表達(dá)或低表達(dá)對心
　　肌細(xì)胞損傷及心肌細(xì)胞自噬活性的影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用自噬的誘導(dǎo)劑或抑制劑，觀察新生大鼠心肌細(xì)胞在

14、高糖環(huán)境中Bmal1基因低表達(dá)或過表達(dá)對心肌損傷的影響，以探究大鼠心肌細(xì)胞Bmal1基因是否通過調(diào)控自噬在高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮作用。
　　方法：
　　通過Bmal1 cDNA或sh RNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，造成心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)或低表達(dá)，分別以p cDNA或SC shRNA作為對照組，將轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞分別置于高糖和正常葡萄糖環(huán)境中培養(yǎng)。具體分組如下：（1）Bmal1 cDNA+高糖處理組；（2）p cDNA+高糖

15、處理組；（3）Bmal1 cDNA+正常糖處理組；（4）p cDNA+正常糖處理組；（5）Bmal1 shRNA+高糖處理組；（6）SC shRNA+高糖處理組；（7）Bmal1 shRNA+正常糖處理組；（8）SC shRNA+正常糖處理組。通過Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白
　　LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12–5、P62分析心肌細(xì)胞自噬情況，并進(jìn)一步通過應(yīng)用BAF，以ΔLC3-II表示自噬流水平，來更

16、準(zhǔn)確的評估兩組的自噬活性。并在此基礎(chǔ)上通過進(jìn)一步應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rap）或抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）誘導(dǎo)或抑制自噬，實驗分組如下：（1）p cDNA+高糖；（2）Bmal1 cDNA+高糖；（3）Bmal1 cDNA+高糖+3-MA；（4） SC shRNA+高糖；（5）Bmal1 shRNA+高糖；（6）Bmal1 shRNA+高糖+Rap。應(yīng)用Live/Dead染色觀察各組細(xì)胞死亡情況，通過TUNEL染色和Wester

17、n blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、CARP分析各組細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。
　　結(jié)果：
　　1.與p cDNA對照組相比，新生大鼠心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)對正常葡萄糖條件下心肌細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12–5、p62和ΔLC3-II沒有明顯差別，但在高糖環(huán)境中Bmal1基因過表達(dá)對高糖抑制的心肌細(xì)胞自噬具有顯著上調(diào)作用。
　　2.與SC shRNA對照組相比，新生大鼠心肌細(xì)

18、胞Bmal1基因低表達(dá)對正常葡萄糖條件下心肌細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12–5、p62和ΔLC3-II沒有明顯影響，但在高糖環(huán)境中Bmal1基因低表達(dá)明顯下調(diào)心肌細(xì)胞的自噬活性。
　　3.在高糖條件下心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)上調(diào)自噬的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用3-MA抑制自噬活性后，高糖條件下心肌細(xì)胞的凋亡和死亡均明顯增多，表明抑制自噬活性可在一定程度上逆轉(zhuǎn)Bmal1過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)

19、作用。在高糖條件下Bmal1低表達(dá)下調(diào)自噬的基礎(chǔ)上進(jìn)一步運(yùn)用Rap誘導(dǎo)自噬后，心肌細(xì)胞的凋亡和死亡顯著降低，表明誘導(dǎo)自噬可在一定程度上逆轉(zhuǎn)Bmal1低表達(dá)加重高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用。
　　結(jié)論：
　　1.Bmal1基因低表達(dá)或過表達(dá)對正常葡萄糖環(huán)境中的新生大鼠心肌細(xì)胞的自噬無明顯影響，Bmal1基因過表達(dá)可顯著上調(diào)高糖抑制的新生大鼠心肌細(xì)胞自噬，Bmal1基因低表達(dá)可明顯降低高糖條件下新生大鼠心肌細(xì)胞的自噬活性。

20、>　　2.Bmal1是通過調(diào)控自噬在高糖誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮作用的，Bmal1基因過表達(dá)誘導(dǎo)自噬在高糖誘導(dǎo)的心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用，Bmal1基因低表達(dá)抑制自噬則加重高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。
　　第四部分：生物鐘基因Bmal1通過mTOR信號通路調(diào)控心肌細(xì)胞的自噬活性
　　目的：
　　分析Bmal1調(diào)控心肌細(xì)胞自噬參與新生大鼠心肌細(xì)胞損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：
　　1.觀察新生大鼠在高糖環(huán)境中Baml1基因過表達(dá)或低表達(dá)

21、對mTOR信號通路分子表達(dá)的影響；
　　2.并進(jìn)一步誘導(dǎo)或抑制mTOR信號通路活性以觀察新生大鼠心肌細(xì)胞在高糖環(huán)境中Bmal1基因低表達(dá)或過表達(dá)對自噬的影響。
　　方法：
　　通過Bmal1 cDNA或sh RNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，造成心肌細(xì)胞Bmal1基因過表達(dá)或低表達(dá)，分別以p cDNA或SC shRNA作為對照組，將轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞分別置于高糖和正常葡萄糖環(huán)境中培養(yǎng)。具體分組如下：（1）Bmal1 cDNA+高糖處理

22、組；（2）p cDNA+高糖處理組；（3）Bmal1 cDNA+正常糖處理組；（4）p cDNA+正常糖處理組；（5）Bmal1 shRNA+高糖處理組；（6）SC shRNA+高糖處理組；（7）Bmal1 shRNA+正常糖處理組；（8）SC shRNA+正常糖處理組。通過Western blot檢測mTOR通路相關(guān)分子 p-mTOR2448、mTOR、p-p70S6K、p-70S6K、p-S6、S6、p-4E-BP1、4E-BP1、

23、p-ULK1、ULK1。隨后進(jìn)一步通過應(yīng)用mTOR通路抑制劑Rap或轉(zhuǎn)染mTOR進(jìn)一步抑制或上調(diào)mTOR通路的表達(dá)，分組如下：（1）Bmal1 cDNA+mTOR+高糖；（2）Bmal1 cDNA+高糖；（3）p cDNA+mTOR+高糖；（4）p cDNA+高糖；（5）Bmal1 shRNA+Rap+高糖；（6）Bmal1 shRNA+高糖；（7）SC shRNA+Rap+高糖；（8）SC shRNA+高糖。通過Western blo

24、t檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-II、LC-I、BECN1、ATG12–5、P62分析心肌細(xì)胞自噬情況，并進(jìn)一步通過應(yīng)用BAF，以ΔLC3-II表示自噬流水平，來更準(zhǔn)確的評估兩組的自噬活性。
　　結(jié)果：
　　1.與正常葡萄糖組相比，高糖組的mTOR通路中的p-p70S6K、p-S6和p-4EBP明顯升高，表明高糖可激活mTOR通路。此外，與p cDNA組相比，高糖環(huán)境下Bmal1基因過表達(dá)對mTOR通路中的p-p70S6K、p-S

25、6和p-4EBP有明顯抑制作用，Bmal1基因低表達(dá)對該通路有明顯上調(diào)作用，而正常糖條件下，兩組無明顯差異，表明只有在高糖環(huán)境中 Bmal1基因方可激活的mTOR通路。
　　2.在Bmal1過表達(dá)誘導(dǎo)自噬的基礎(chǔ)上進(jìn)一步過表達(dá)mTOR后，可明顯減輕Bmal1過表達(dá)誘導(dǎo)的自噬，在Bmal1低表達(dá)下調(diào)自噬的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用mTOR的抑制劑Rap可顯著逆轉(zhuǎn)Bmal1低表達(dá)對自噬的抑制。
　　結(jié)論：
　　1.高糖條件下新生大鼠B