弓形蟲SAG1基因原核表達(dá)與間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)致病原蟲(opportunisticprotozoan)，能感染幾乎所有恒溫動(dòng)物(包括人類)，引起弓形蟲病。在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊，造成隱性感染；對(duì)于免疫功能下降的宿主(如腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，可引起嚴(yán)重的臨床癥狀甚至導(dǎo)致宿主死亡。 弓形蟲膜表面蛋白1(SAG1)是弓形蟲速殖子期的特異性抗原，具有很強(qiáng)的免疫原性，是弓形蟲診斷和疫

2、苗研究的重要候選抗原分子。SAG1在原蟲中含量較低，利用基因工程技術(shù)在體外表達(dá)蛋白可以獲得大量高純度SAG1。 本研究根據(jù)己發(fā)表的SAG1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以弓形蟲基因組DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增出SAG1基因的主要抗原片段P30(S)，構(gòu)建T-A克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定后進(jìn)行測序。將正確的P30(S)基因片段亞克隆入pET-28a(+)原核表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白

3、P30(S)。純化后的P30(S)經(jīng)SDS-PAGE與Western-blot驗(yàn)證，該融合蛋白分子量大小介于26-35kD之間，符合預(yù)期大??；可與大鼠弓形蟲病陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫原性，可以作為抗原檢測大鼠弓形蟲病血清抗體。 以純化的P30(S)作為包被抗原，經(jīng)試驗(yàn)確定最佳抗原包被濃度、血清和酶標(biāo)抗體稀釋濃度，建立大鼠弓形蟲病抗體間接ELISA檢測方法。通過特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)以及對(duì)比試驗(yàn)，表明本研