基于組合質(zhì)譜技術的新型抗結核組合藥物臨床前藥代動力學與代謝相互作用研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的單一致病菌慢性傳染性疾病，已成為繼HIV/AIDS后世界上威脅人類生命健康的第二大疾病。2013年全球結核病新增發(fā)病人數(shù)為900萬，死亡人數(shù)為150萬。目前結核病臨床治療多采用聯(lián)合用藥的方式預防耐藥結核病的發(fā)生，但服用藥物多，服藥周期長，毒副作用強，成本高是現(xiàn)行主流療法面臨的重大難題。本文基于前期反饋系統(tǒng)控制技術(FSC)對已有抗結核藥物進行篩選和組合的

2、基礎上，較為全面地研究了新型抗結核組合藥物EMB、PZA、CLZ和PRO在SD大鼠和Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學特征及體內(nèi)吸收、代謝方面可能存在的藥物相互作用，為新型抗結核組合藥物在臨床上的應用提供參考數(shù)據(jù)。
　　一、標準抗結核組合藥物定量分析方法的建立和臨床前藥代動力學研究
　　WHO推薦的標準抗結核組合藥物包括RFP、INH、EMB和PZA，文獻多采用LC-MS/MS方法進行四個藥物的藥代動力學研究及其臨床治療藥物監(jiān)測

3、。四個藥物極性差別較大，給同時定量測定帶來極大困難。本章通過考察不同液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的適用性，色譜柱的選擇，梯度洗脫程序的優(yōu)化，克服了EMB和INH的基質(zhì)干擾，建立了一個靈敏度高、特異性好、重現(xiàn)性好的LC-MS/MS方法同時對SD大鼠和Beagle犬血漿中的上述四種藥物進行定量分析。血漿樣品經(jīng)乙腈蛋白沉淀后，上清液采用Waters Atlantis dC18色譜柱，以甲醇∶乙腈(1∶1，v/v)為有機相、0.1％甲酸水溶液為水相進行快

4、速梯度洗脫，四個藥物和內(nèi)標4min內(nèi)洗脫完全且色譜峰型良好，單個樣品分析周期為6min。SD大鼠和Beagle犬血漿中上述四種藥物定量分析方法學驗證結果符合FDA關于生物樣品分析的相關規(guī)定，該方法被成功地應用于標準抗結核組合藥物在SD大鼠和Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學研究中。
　　二、新型抗結核組合藥物定量分析方法的建立和SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究
　　本章在前一章分析方法研究的基礎上，建立了一個LC-MS/MS方法對新

5、型抗結核組合藥物中EMB、PZA、CLZ和PRO同時進行定量分析。20μL血漿樣品采用Sirocco96孔蛋白沉淀板進行快速、高通量的分離純化，隨后在Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱上，以甲醇和5mM醋酸銨+0.1％甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，四個藥物和內(nèi)標7min內(nèi)洗脫完全且色譜峰型良好，單個樣品分析周期為10min。SD大鼠血漿中上述四種藥物定量分析方法學驗證結果符合FDA關于生物樣品分析的相關規(guī)定，該方法被成功地應用

6、于新型抗結核組合藥物在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學及其相互作用研究中。
　　對比分析SD大鼠單劑量給四個單藥和新型抗結核組合藥物后四個藥物的主要藥代動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥后可能會延緩EMB在SD大鼠體內(nèi)的吸收，促進PRO的吸收，但兩者的t1/2和MRT均無明顯差異，說明聯(lián)合給藥對大鼠腸吸收轉運產(chǎn)生影響，但對藥物的消除影響不大。CLZ和PZA的藥代動力學參數(shù)無明顯差異，提示聯(lián)合給藥后對兩者無明顯藥物相互作用。SD大鼠多劑量給藥四個單藥

7、及其組合藥物第五天后，體內(nèi)四個藥物的血藥濃度均已基本達到穩(wěn)態(tài)。通過分析對比單劑量和多劑量給四種單藥及組合藥物后四個藥物的藥代動力學參數(shù)可以看出，連續(xù)給藥七天后四個藥物在SD大鼠體內(nèi)均有蓄積，但是tmax，t1/2和MRT值無明顯差異，說明藥物在體內(nèi)的蓄積不會影響機體代謝特征。
　　三、新型抗結核組合藥物在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學研究
　　為了進一步了解新型抗結核組合藥物的臨床前藥代動力學特征，本章沿用第三章的LC-MS

8、/MS法結合Sirocco96孔蛋白沉淀板樣品前處理的方法對新型抗結核組合藥物在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學研究和及其相互作用進行考察。通過分析單藥和組合藥物的單劑量實驗后Beagle犬體內(nèi)四個藥物的藥代動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥后會延緩機體對EMB的吸收，促進CLZ的吸收，但是對PRO的吸收會有抑制，對PZA無明顯影響。多劑量給新型抗結核組合藥物第五天開始，Beagle犬體內(nèi)EMB、PZA和CLZ的血藥濃度已基本達到穩(wěn)態(tài)。通過分析單劑

9、量和多劑量給組合藥物后四個藥物的藥代動力學參數(shù)，表明連續(xù)七天給藥后PZA和PRO均無明顯的蓄積，藥代動力學參數(shù)無明顯差異，說明連續(xù)給藥七天不影響PZA和PRO在機體內(nèi)的藥代動力學特征。而EMB和CLZ在Beagle犬體內(nèi)有明顯的蓄積，但tmax，t1/2和MRT值無明顯差異，說明這兩個藥物在Beagle犬體內(nèi)的蓄積不會影響機體代謝特征。
　　四、新型抗結核組合藥物對SD大鼠肝微粒體主要藥物代謝酶活性的影響
　　本章采用LC-

10、UV方法對SD大鼠肝微粒體中三種主要藥物代謝酶的特異性探針底物非那西丁(CYP1A2)、咪達唑侖(CYP3A4)和氯唑沙宗(CYP2E1)及其主要代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚、1'-羥基咪達唑侖和6-羥基氯唑沙宗進行測定，考察了SD大鼠分別連續(xù)給EMB、PZA、CLZ、PRO單藥和新型抗結核組合藥物14天后對上述三種代謝酶活性的影響。
　　通過與空白組相比發(fā)現(xiàn):對于CYP1A2而言，SD大鼠連續(xù)14天給藥EMB后對CYP1A2無明顯作用，

11、PZA、CLZ、PRO以及組合藥物組對CYP1A2存在誘導作用;SD大鼠性別之間沒有差異。對于CYP3A4而言，SD大鼠分別連續(xù)14天給四個單藥以及組合藥物后對CYP3A4均無明顯作用;但SD大鼠表現(xiàn)出性別差異。對于CYP2E1而言，SD大鼠分別連續(xù)14天給藥PZA、CLZ、PRO、EMB后對CYP2E1均無明顯作用，而組合藥物組對CYP2E1存在誘導作用;SD大鼠性別之間沒有差異。CYP1A2參與了咖啡因、茶堿等20多種藥物的代謝，新