GhEF1A8啟動子克隆與功能分析及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花研究.pdf

1、棉花（Gossypium spp.）屬被子植物門、雙子葉植物綱、錦葵目、錦葵科木槿亞科、棉屬，是一種多用途的重要經(jīng)濟作物。早在9世紀便在中國發(fā)現(xiàn)棉花的種植，發(fā)展至今我國已成為世界最大產(chǎn)棉國之一，種植范圍遍及國內(nèi)25個省市自治區(qū)，創(chuàng)造了大量的經(jīng)濟收益和社會價值。近年來轉(zhuǎn)基因棉花特別是轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花與抗蟲棉在世界范圍內(nèi)的大規(guī)模推廣和應(yīng)用，變革了傳統(tǒng)的棉花耕種模式，大幅提高了棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究已經(jīng)取得了較大的進展，

2、但轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花的研制卻起步較晚，并未育成高效穩(wěn)定的抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花品種，為此本研究從植物基因工程角度出發(fā)，通過克隆分離棉花地上組織高效表達啟動子、優(yōu)化改造草甘膦抗性基因、外源多基因組裝策略等方面的研究，對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花的研究進行了新的探索。
　　首先以棉花組成型高表達蛋白質(zhì)延伸因子（GhEF1A）基因家族為切入點，對其9個家族成員的組織表達特性進行分析，進而采用基因組染色體步移（TAIL-PCR）技術(shù)分離獲得GhEF1

3、A8基因上游啟動子區(qū)域序列，在運用生物信息學手段對啟動子結(jié)構(gòu)及其調(diào)控區(qū)域中潛在的順式作用元件進行分析預(yù)測的基礎(chǔ)之上，構(gòu)建了啟動子全長、5’UTR缺失及一系列啟動子5’端缺失片段的植物表達載體，通過轉(zhuǎn)基因煙草 GUS的組織化學染色及熒光酶活測定，對啟動子的組織表達特性及其活性調(diào)控的分子機理進行了分析。同時對抗草甘膦新型EPSP合酶gr79基因及N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因進行了密碼子改造和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化，結(jié)合GhEF1A8啟動子與棉花葉綠體前導

4、肽（GhCTP）等載體元件構(gòu)建了一系列單雙價植物表達載體，通過轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學分析及草甘膦抗性鑒定,初步驗證了抗草甘膦基因的抗性，并獲得了對草甘膦有較強抗性的雙價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花?；谏鲜鲅芯浚玫街饕Y(jié)果如下：
　　1.對棉花GhEF1A基因家族表達特性分析發(fā)現(xiàn)其9個基因家族成員（GhEF1A1-GhEF1A9）高度同源，但在棉花葉片中表達強度有顯著差異，其中GhEF1A8基因表達量達到內(nèi)參基因Ghubi表達

5、量的8倍，遠高于其他家族成員。此外GhEF1A8基因在棉花各組織部位都能表達，其中莖組織部位表達強度僅此于葉片基因表達量，表達量為內(nèi)參基因Ghubi的5倍以上。
　　2.首次分離獲得GhEF1A8基因上游啟動子區(qū)，TAIL-PCR分離得到的序列片段長1679-bp，其中包含了143-bp GhEF1A8基因編碼序列。采用PlantCARE、PLACE及ScanWM-P等生物信息學工具對啟動子結(jié)構(gòu)及潛在的順式調(diào)控元件進行預(yù)測分析，發(fā)

6、現(xiàn)GhEF1A8啟動子不僅存在TATA-box、CAAT-box、GC富集區(qū)等高等植物啟動子基本調(diào)控元件，同時還包含了多種的逆境應(yīng)答元件及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如GT-1 motif、W-box、LTR和A/T-rich等。除此之外克隆得到的序列片段中包含了一個長度為242-bp的5’UTR區(qū)域，該區(qū)域中存在一個非翻譯的外顯子、一個植物內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及一個5’UTR Py-rich stretch元件。
　　3.基于生物信息學分析結(jié)果，構(gòu)建了

7、GhEF1A8啟動子全長、5’UTR缺失及一系列啟動子5’端缺失片段的植物表達載體并進行了轉(zhuǎn)化煙草研究。GUS組織化學染色及熒光酶活測定分析顯示， GhEF1A8啟動子主要在煙草植株的地上組織表達，在葉片及莖組織中表達強度分別為CaMV啟動子的2倍和4倍。5’UTR能夠在幾乎所有組織器官中增強GhEF1A8啟動子的表達，尤其是在煙草葉片和莖組織中GUS活性分別提高了400％和600%。此外5’端序列缺失分析結(jié)果表明，-1081/-869

8、和-869/-373序列區(qū)域是啟動子基本活性的正調(diào)控區(qū)，A/T-rich元件對啟動子活性有增強作用。
　　4.對抗草甘膦新型EPSP合酶gr79基因及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因進行了密碼子改造和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化，結(jié)合GhEF1A8啟動子與棉花葉綠體前導肽（GhCTP）等載體元件構(gòu)建了一系列單雙價植物表達載體并進行了轉(zhuǎn)化煙草和棉花的研究。通過分子生物學分析及草甘膦抗性鑒定，證明轉(zhuǎn)化了gr79與gat基因的煙草與棉花獲得了一定的草甘膦

9、抗性，并初步比較了各基因及各載體轉(zhuǎn)化煙草植株的草甘膦抗性差異。
　　5.對獲得的雙價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花T0代及T1代植株進行了進一步分析，Southern blot、Western blot及大田草甘膦抗性實驗結(jié)果說明gr79與gat基因已經(jīng)穩(wěn)定整合在棉花基因組中，但不同轉(zhuǎn)基因株系基因拷貝有差異，gr79基因能夠在棉花中被正確翻譯為目標蛋白。獲得的雙價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花具有較強抗性,其抗性能初步達到田間草甘膦噴施要求，并且轉(zhuǎn)基因棉