TRAP1對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻?在毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致有效循環(huán)血容量顯著減少之前,即可出現(xiàn)心肌缺血缺氧損害及心臟泵血功能減弱。這種傷后早期出現(xiàn)的心肌損害,不僅易引起心功能不全,還可誘發(fā)或加重休克,成為燒傷后早期機(jī)體缺血缺氧的重要啟動(dòng)因素之一。研究表明缺氧不僅在燒傷早期心肌損害的發(fā)生過程中有著重要的作用,而且也參與了多種心臟疾病的病理生理過程。因此,研究缺氧條件下心肌細(xì)胞的損害機(jī)制對(duì)于闡明嚴(yán)重?zé)齻燃膊∫鸬男募p害的發(fā)生機(jī)制有著重要的意義。線粒體是細(xì)胞能

2、量生成的主要場所,其也參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡和壞死。在缺氧條件下,心肌細(xì)胞線粒體最易受到損傷,其結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂直接導(dǎo)致了缺氧心肌細(xì)胞的死亡。研究發(fā)現(xiàn)缺氧等有害刺激可以引起線粒體基質(zhì)腫脹,膜電位下降,外膜破裂,導(dǎo)致其通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)開放增加,細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cytc)等促凋亡物質(zhì)釋放進(jìn)入胞液,激活線粒體依賴的凋亡途徑,最終造

3、成細(xì)胞的死亡。MPTP大量開放導(dǎo)致的線粒體不可逆損傷是心肌細(xì)胞凋亡和壞死發(fā)生過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MPTP是貫穿于線粒體內(nèi)外膜由多種蛋白質(zhì)組成的一個(gè)復(fù)合蛋白通道,其確切成分目前還存在著爭議,但越來越多的研究認(rèn)為親環(huán)素D(cyclophilin D,CypD)是其中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)蛋白。CypD被證實(shí)介導(dǎo)了多種因素引起的MPTP開放過程,抑制CypD的肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶的活性能夠阻斷MPTP的開放。
　　 腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1(

4、tumor necrosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)是一個(gè)分布在線粒體,屬于熱休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)家族,分子量約為75KDa的分子伴侶。與典型的HSP90家族相比,TRAP1有著相似的ATP酶活性,其酶活性能夠被HSP90特異性抑制劑格爾德霉素抑制,但其在調(diào)節(jié)線粒體功能方面又有著獨(dú)特的作用。既往研究表明,缺氧能夠誘導(dǎo)細(xì)胞HSP9

5、0表達(dá)增加,并且這種變化對(duì)細(xì)胞缺氧性損害起著保護(hù)作用,但缺氧后心肌細(xì)胞TRAP1的變化趨勢(shì)及作用目前還不清楚。TRAP1分布廣泛,在維持線粒體的自我穩(wěn)定狀態(tài)、調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死的過程中起著重要的作用。由于MPTP的開放是細(xì)胞凋亡和壞死發(fā)生過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),并且進(jìn)一步研究證實(shí)TRAP1在腫瘤細(xì)胞中與MPTP的重要調(diào)節(jié)蛋白CypD存在著相互作用。因此我們推測:缺氧后心肌細(xì)胞TRAP1的變化能夠通過作用于CypD來影響MPTP的開放,從而

6、發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。本研究旨在對(duì)此假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 一、研究目的:
　　 探討缺氧后心肌細(xì)胞TRAP1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞缺氧性損害的保護(hù)作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　 二、材料方法:
　　 1.原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,建立細(xì)胞缺氧模型。
　　 2.應(yīng)用免疫印跡及免疫熒光技術(shù)觀察常氧及不同缺氧時(shí)間處理后(缺氧1h,3h,6h和12h)心肌細(xì)胞TRAP1的表達(dá)變化。然后通過構(gòu)建腺病毒載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞干預(yù)T

7、RAP1的表達(dá),觀察其對(duì)缺氧心肌細(xì)胞(缺氧6h)的細(xì)胞活力和死亡的影響,從而明確缺氧后心肌細(xì)胞TRAP1表達(dá)的變化趨勢(shì)以及這種變化對(duì)細(xì)胞缺氧損害的作用。
　　 3.選用能反映MPTP開放的線粒體膜電位和細(xì)胞溶質(zhì)中Cytc的含量作為檢測指標(biāo),分別觀察干預(yù)TRAP1后缺氧心肌細(xì)胞這兩個(gè)指標(biāo)以及caspase3活性的改變,明確TRAP1能夠調(diào)節(jié)缺氧心肌細(xì)胞MPTP的開放,并進(jìn)而影響線粒體依賴的凋亡途徑。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用MPTP特異性阻斷

8、劑CsA阻斷MPTP開放,探討其能否阻止下調(diào)TRAP1表達(dá)對(duì)缺氧心肌caspase3活性、細(xì)胞活力和死亡的作用,以此來闡明TRAP1通過減少M(fèi)PTP開放,調(diào)節(jié)線粒體依賴的凋亡途徑,從而發(fā)揮對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 4.運(yùn)用免疫共沉淀和蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)明確TRAP1與CypD是否存在相互作用,同時(shí)檢測干預(yù)TRAP1的表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞CypD蛋白和基因表達(dá)的影響。此外觀察單純?nèi)毖跻约癕PTP開放抑制劑CsA對(duì)CypD蛋白和基因

9、表達(dá)的影響,從而明確TRAP1可能是通過作用于CypD來調(diào)節(jié)MPTP開放。
　　 三、主要結(jié)果
　　 1.心肌細(xì)胞缺氧處理1h后,TRAP1的表達(dá)較常氧狀態(tài)下即增加,并且隨著缺氧時(shí)間的延長,TRAP1增加越明顯,至缺氧后12h,TRAP1的表達(dá)與常氧組相比仍顯著增多。
　　 2.缺氧6h后,過表達(dá)TRAP1減輕了缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞活力降低和死亡增加,而下調(diào)TRAP1表達(dá)則加重了缺氧引起的上述細(xì)胞損傷。
　　

10、 3.缺氧6h后,過表達(dá)TRAP1減輕了缺氧導(dǎo)致的線粒體膜電位下降、細(xì)胞溶質(zhì)中Cytc含量及胞漿中caspase3活性增加,而下調(diào)TRAP1表達(dá)則加重了缺氧引起的上述損傷。使用MPTP開放特異性阻斷劑CsA能夠阻斷下調(diào)TRAP1表達(dá)引起的缺氧心肌細(xì)胞活力下降、細(xì)胞死亡和caspase3活性增加。
　　 4.常氧及缺氧條件下,心肌細(xì)胞中TRAP1和CypD均不存在著相互作用。過表達(dá)TRAP1能夠使常氧心肌細(xì)胞CypD mRNA的

11、表達(dá)增加,而下調(diào)TRAP1表達(dá)則降低了CypD mRNA的表達(dá)水平,但干預(yù)TRAP1表達(dá)對(duì)CypD蛋白含量沒有明顯作用。缺氧6h后,心肌細(xì)胞CypD mRNA的表達(dá)量較常氧組顯著降低,而CsA在常氧和缺氧條件下均能增加CypD mRNA的表達(dá)量。同樣缺氧及CsA處理后,心肌細(xì)胞CypD蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。
　　 四、結(jié)論
　　 1.缺氧能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TRAP1表達(dá)增多,并且隨著缺氧時(shí)間的延長,TRAP1的增多越明