間充質(zhì)干細(xì)胞通過可溶性因子介導(dǎo)白血病細(xì)胞耐藥的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　白血病是小兒惡性腫瘤中發(fā)病率最高的一種，雖然大多兒童的急性白血病能通過化療治愈，但耐藥及治療相關(guān)毒性仍是其治療中面臨的重要挑戰(zhàn)。近年來，靶向腫瘤微環(huán)境的輔助化療逐漸成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　在過去十年的研究中，人們發(fā)現(xiàn)在造血微環(huán)境中骨髓造血干細(xì)胞和周邊細(xì)胞的相互作用及影響，造血細(xì)胞的生長由骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和由細(xì)胞黏附為起點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)緊密調(diào)節(jié)。造血微環(huán)境在骨髓腔中定位于“干細(xì)胞龕”，

2、后者是造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)聚集的地方，包括成骨細(xì)胞(骨內(nèi)膜)龕和血管龕，分別給促成造血的長期HSC及周期活躍的短期HSC提供一個(gè)微環(huán)境，協(xié)同調(diào)節(jié)HSC的自我更新、增殖、分化和在骨髓內(nèi)外的移動(dòng)。骨髓微環(huán)境中特殊的“龕”為腫瘤細(xì)胞提供一個(gè)逃避化療毒性凋亡的居所并獲得耐藥表型。
　　作為骨髓微環(huán)境中的重要成員，MSC是存在于血竇表面并促成竇壁結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的自我更新的祖細(xì)胞，產(chǎn)生血管生成素-1并

3、能產(chǎn)生成骨細(xì)胞，形成骨內(nèi)膜龕。MSC產(chǎn)生功能不同的細(xì)胞(成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)，形成不同的結(jié)構(gòu)(骨表面和竇壁)，是組成造血微環(huán)境的關(guān)鍵成分，在支持造血中扮演一個(gè)重要的角色。MSC還是一種具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，其重要特點(diǎn)是能夠逃避免疫識(shí)別、抑制免疫反應(yīng)，也因此成功的被應(yīng)用于臨床上許多疾病的治療中，如移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、心肌梗死及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。但與此同時(shí)，它在多種腫瘤體系中被證明能通過多種粘附和非粘附機(jī)制及

4、其多重信號(hào)通路引起腫瘤耐藥。
　　血液惡性腫瘤病人的化療后HSC和MSC共移植研究表明，同時(shí)植入MSC和HSC的病人，比起只植入HSC的病人有更高的復(fù)發(fā)率。這種復(fù)發(fā)率的升高，不能排除與MSC導(dǎo)致的耐藥有一定的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究證明。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MSC和腫瘤細(xì)胞混合注射的小鼠平均腫瘤容量大，也提示了MSC對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用。
　　盡管MSC在骨髓中的數(shù)量不多，但MSC及其衍生的基質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性因子通過旁分泌作用在

5、骨髓龕中直接作用于腫瘤細(xì)胞。其中，MSC分泌的細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)在當(dāng)中扮演著重要角色。MSC通過可溶性因子IL-6介導(dǎo)的耐藥涉及黏附依賴性機(jī)制及非黏附依賴性機(jī)制及多重信號(hào)通路，這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過調(diào)節(jié)Bcl-2等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長、分化和抗凋亡。
　　此外，以環(huán)氧化酶2(Cycloxygenase，COX-2)為關(guān)鍵酶的前列腺素E2在MSC介導(dǎo)的耐藥中也有重要作用。COX-2通過抑制神經(jīng)鞘磷脂酶的活性和神經(jīng)酰胺的

6、產(chǎn)生，及調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、Akt通路活化及細(xì)胞對(duì)NO的易感性，從而對(duì)抗凋亡。依托考昔作為改良后的COX-2抑制劑，在腫瘤的防治中可能仍有很大發(fā)展空間。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1．了解急性白血病患兒骨髓上清及間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-6水平，探討其臨床意義。
　　2．探索間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的可溶性因子通過非粘附介導(dǎo)的機(jī)制對(duì)Jurkat、K562、K562/A02等白血病細(xì)胞株在細(xì)胞毒性藥物處理下的保護(hù)作用。<

7、br>　　3．探討COX-2抑制劑依托考昔對(duì)MSC的可溶性因子介導(dǎo)耐藥的干預(yù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1．從骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，制備間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
　　2．用流式細(xì)胞儀鑒定MSC表面CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR抗原。
　　3．酶聯(lián)免疫法檢測(cè)非白血病和白血病兒童骨髓上清及骨髓分離培養(yǎng)的MSC培養(yǎng)液中IL-6的含量。
　

8、　4． MSC條件培養(yǎng)基作用于白血病細(xì)胞株Jurkat、K562及K562/AO2，流式細(xì)胞儀檢測(cè)多柔比星誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞株的凋亡率，檢測(cè)白血病細(xì)胞株的細(xì)胞周期。
　　5．熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2、Mcl-1、COX-2基因表達(dá)量。
　　6．改良 MTT法檢測(cè)細(xì)胞株在多柔比星、柔紅霉素、長春新堿、阿糖胞苷、門冬酰胺酶、地塞米松等化療藥物誘導(dǎo)下的藥物抑制曲線及依托考昔干預(yù)下的藥物抑制曲線。
　　7．用COX-2抑制劑

9、依托考昔干預(yù)，檢測(cè)多柔比星誘導(dǎo)下白血病細(xì)胞株凋亡率及細(xì)胞周期，和Bcl-2、Mcl-1、COX-2基因表達(dá)量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. MSC陽性表達(dá)CD90、CD105、CD73,而CD34、CD45、HLA-DR、CD14、CD19、CD79a、CD11b則呈陰性。
　　2.所有檢測(cè)對(duì)象中不同性別間、不同年齡間兒童骨髓上清IL-6水平的差別無顯著意義；非白血病患兒與處于完全緩解期的白血病患兒骨髓 IL-6水平的差

10、別無顯著意義；初診及骨髓未緩解的白血病患兒骨髓上清 IL-6水平明顯高于非白血病組及化療后處于完全緩解期的白血病患兒組（P＜0.05）；初診及骨髓未緩解白血病患兒中急性髓細(xì)胞白血病患兒骨髓 IL-6水平高于急性淋巴細(xì)胞白血病患兒（P＜0.05）。處于完全緩解期的不同類型白血病患兒骨髓IL-6水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，按白血病診療建議中分類的低、中、高危患兒 IL-6水平差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.白血病患兒與非白血病患兒 MSC條件

11、培養(yǎng)基中 IL-6水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；所有檢測(cè)對(duì)象不同性別、年齡及白血病類型之間的MSC條件培養(yǎng)基中IL-6水平的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。急性淋巴細(xì)胞白血病患兒中，中高危患兒MSC條件培養(yǎng)基中IL-6水平比低?；純荷愿撸顒e無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4. Jurkat、K562及K562/AO2細(xì)胞株的MSC條件培養(yǎng)基組加多柔比星誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞存活率高于只加多柔比星的對(duì)照組（P＜0.05）；加 MSC條件培養(yǎng)基后，三種白

12、血病細(xì)胞株的細(xì)胞周期均出現(xiàn)阻滯，G0-G1期細(xì)胞比例增加（P＜0.05）；
　　5. MSC條件培養(yǎng)基能上調(diào)Jurkat、K562及K562/AO2白血病細(xì)胞株Bcl-2基因的表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)K562/AO2的COX-2基因表達(dá)（P＜0.05）；
　　6. Jurkat細(xì)胞株、K562細(xì)胞株及K562/AO2細(xì)胞株單獨(dú)加依托考昔時(shí)，均未出現(xiàn)生長抑制，Jurkat細(xì)胞株聯(lián)用依托考昔及多柔比星、柔紅霉素、長春新堿或門冬

13、酰胺時(shí)，均比化療藥單獨(dú)使用時(shí)抑制率提高（Q≥1.15）；聯(lián)用依托考昔及地塞米松時(shí)抑制率降低，表現(xiàn)出拮抗作用（Q＜0.85）； K562細(xì)胞株聯(lián)用依托考昔及阿糖胞苷、多柔比星或柔紅霉素時(shí)，表現(xiàn)出協(xié)同作用（Q≥1.15）； K562/AO2細(xì)胞株聯(lián)用依托考昔及多柔比星時(shí)，表現(xiàn)出協(xié)同作用（Q≥1.15）。
　　7.白血病細(xì)胞株加依托考昔不能增加凋亡，能使多柔比星誘導(dǎo)的凋亡及壞死增多。單獨(dú)加依托考昔后白血病細(xì)胞株的細(xì)胞周期與對(duì)照組差別無統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義；加MSC條件培養(yǎng)基再加依托考昔干預(yù)組，S期及 G2-M期的細(xì)胞比例增加。K562/AO2細(xì)胞株加依托考昔后COX-2基因的表達(dá)輕微下調(diào)（P＞0.05），依托考昔對(duì)Mcl-1及Bcl-2的表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.急性白血病患兒的骨髓 IL-6異常升高，可能與其白血病類型及腫瘤負(fù)荷有關(guān)；其骨髓分離培養(yǎng)的MSC能分泌IL-6。
　　2. MSC通過非細(xì)胞粘附機(jī)制不能上調(diào)Jurkat、K562、K

15、562/AO2細(xì)胞株Mcl-1基因的表達(dá)，能上調(diào)三種細(xì)胞株 Bcl-2基因的表達(dá)，上調(diào)K562/AO2的COX-2基因表達(dá)，Jurkat及K562細(xì)胞株COX-2基因表達(dá)無明顯上調(diào)。
　　3. COX-2特異性抑制劑依托考昔，不能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，不能明顯改變白血病細(xì)胞周期，但在體外化療藥物作用于白血病細(xì)胞株時(shí)，加依托考昔表現(xiàn)增效作用，并能逆轉(zhuǎn)MSC條件培養(yǎng)基引起的周期停滯。COX-2可能在MSC通過可溶性因子介導(dǎo)細(xì)胞周期停