mir-1下調(diào)Dll-1-Hes-1-Notch信號(hào)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化.pdf

1、第一部分 C57BL/c小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和Notch信號(hào)檢測(cè)
　　目的:(1)體外分離培養(yǎng)C57BL/c小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs);(2)檢測(cè)BMSCs上表達(dá)的Notch信號(hào)。
　　方法:用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs并擴(kuò)增傳代;流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得的第3代細(xì)胞表面標(biāo)志抗原;定向誘導(dǎo)細(xì)胞成骨成脂分化及向內(nèi)皮細(xì)胞分化;RT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)BMSCs上表達(dá)的Notch

2、信號(hào)。
　　結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)的細(xì)胞24小時(shí)內(nèi)可見呈梭形或星形的貼壁細(xì)胞，在2周內(nèi)可擴(kuò)增至106個(gè)數(shù)量級(jí);第3代后的細(xì)胞呈較均一的梭狀、成纖維狀;傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，增殖能力強(qiáng)。(2)流式細(xì)胞檢測(cè)顯示細(xì)胞表達(dá)MSCs特異性表面抗原CD29和CD90，而內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31和造血干細(xì)胞表面抗原CD34、CD45呈陰性。(3)成功誘導(dǎo)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。(4)RT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)到

3、細(xì)胞上表達(dá)Notch通路中的Notch-1、NotCh-2、Notch-4、Dll-1、Dll-4、Jag-1、Hes-1和Hey-1分子。
　　結(jié)論:用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合可獲得純度較高的BMSCs，傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，增殖能力強(qiáng)，具有多向分化潛能;BMSCs上表達(dá)Notch信號(hào)中的Notch-1、Notch-2、Notch-4、Dll-1、Dll-4、Jag-1、Hes-1和Hey-1分子。
　　第二部分

4、miR-1下調(diào)Dll-1-Hes-1/Notch信號(hào)調(diào)控BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化
　　目的:(1)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs第1、7、14天Notch信號(hào)、Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43表達(dá)情況。(2)檢測(cè)沉默Dll-1的BMSCs第1、7、14天Notch下游效應(yīng)分子、Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43變化。(3)檢測(cè)沉默Hes-1的BMSCs第1、7、14天Nkx2.5、GATA-4、cTnT

5、和CX43表達(dá)情況。
　　方法:(1)用pAJ-U6-shRNA-CMV-Puro/GFP載體，構(gòu)建過表達(dá)miR-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，RT-qPCR法和Western Blot法檢測(cè)過表達(dá)miR-1的BMSCs第1、7、14天Notch信號(hào)、Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43表達(dá)情況。(2)構(gòu)建Dll-1-shRNA慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染BMSCs以沉默Dll-1基因，RT-qPCR法和Western Blot法檢

6、測(cè)定向沉默Dll-1的BMSCs第1、7、14天Notch下游效應(yīng)分子、Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43表達(dá)情況。(3)構(gòu)建Hes-1-shRNA的慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染BMSCs以沉默Hes-1基因，RT-qPCR法和Western Blot法檢測(cè)定向沉默Hes-1的BMSCs第1、7、14天Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs在第7、14天Dll-1和

7、Hes-1下調(diào);轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs在第7天有Nkx2.5和GATA-4表達(dá)，第14天時(shí)表達(dá)量下降:cTnT和CX43在轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs第7天開始表達(dá)，第14天表達(dá)量增加。(2)定向沉默Dll-1的BMSCs在第7、14天Hes-1下調(diào)，Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43的表達(dá)情況與轉(zhuǎn)染miR-1后的BMSCs效果相似。(3)定向沉默Hes-1的BMSCs第7、14天Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX

8、43的表達(dá)情況與轉(zhuǎn)染miR-1或定向沉默Dll-1的BMSCs相似。
　　結(jié)論:miR-1可通過下調(diào)Dll-1，繼而使下游效應(yīng)分子Hes-1表達(dá)下降，調(diào)控BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。
　　第三部分驗(yàn)證miR-1靶向基因Dll-1
　　目的:驗(yàn)證Dll-1是否miR-1的直接調(diào)節(jié)靶基因。
　　方法:PCR擴(kuò)增野生型Dll-13'-UTR和突變型mutDll-13'-UTR基因序列，分別與雙酶切PsiCHECKTM-

9、2載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序;miR-1與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后收集裂解細(xì)胞液，用Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測(cè)雙熒光素酶活性判斷Dll-1是否miR-1的靶基因。
　　結(jié)果:在轉(zhuǎn)染克隆有Dll-13'-UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組中，檢測(cè)熒光素酶活性顯示miR-1組與空白組比較P＜0.01;miR-1組與陰性對(duì)照組比較P＜0.01，表明miR-1能與Dll

10、-1的3'-UTR結(jié)合，從而抑制螢光素酶的活性:在轉(zhuǎn)染克隆有mutDll-13'-UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組中，miR-1組與空白組和陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-1不能與mutDll-13'-UTR結(jié)合而抑制螢光素酶的活性。
　　結(jié)論:Dll-1是miR-1的靶基因。
　　第四部分移植轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs對(duì)小鼠心肌梗死區(qū)修復(fù)作用
　　目的:探討轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs對(duì)小鼠心肌梗死區(qū)的修復(fù)作用。

11、>　　方法:結(jié)扎左前降支建立小鼠心肌梗死模型（假手術(shù)組10只），術(shù)前超聲檢測(cè)心功能。80只成功建立心肌梗死的小鼠隨機(jī)分為PBS組、BMSCs組、轉(zhuǎn)染空白載體的BMSCs組（BMSCs null組）和轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs組(BMSCs miR-1組)，每組20只，心梗后第7天分別以25ul PBS溶液或含相應(yīng)細(xì)胞的溶液(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)，開胸直視下分6點(diǎn)注射入梗死區(qū)周邊（5點(diǎn)）及中央?yún)^(qū)。移植4周后超聲檢測(cè)左心室功能，取出小鼠

12、心臟標(biāo)本并測(cè)定梗死面積及梗死區(qū)室壁厚度，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)梗死區(qū)CX43、cTnT、α-SMA、Desmin和Vimentin的表達(dá)情況;采用激光共聚焦顯微鏡觀察移植細(xì)胞存活及分化情況;Western-blot法檢測(cè)梗死區(qū)Notch信號(hào)。
　　結(jié)果:(1)在細(xì)胞移植4周后，超聲檢測(cè)顯示各細(xì)胞移植組心功能明顯優(yōu)于PBS組(P＜0.05或P＜0.01)，而移植BMSCsmiR-1組的心功能較移植BMSCs組或BMSCsnull組改善

13、明顯（均為P＜0.05）;BMSCs組與BMSCs null比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)各細(xì)胞移植組與PBS組比較，梗死面積減?。≒＜0.05或P＜0.01），而移植BMSCsmiR-1組的梗死面積較移植BMSCs組或BMSCsnull組縮?。ň鶠镻＜0.05），而BMSCs組與BMSCsnull組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(3)移植細(xì)胞組梗死區(qū)室壁厚度均較PBS組升高(P＜0.05或P＜0.01)，而BMS

14、Cs miR-1組較BMSCs組或BMSCsnull組室壁厚度增加（均為P＜0.05），而BMSCsnull組梗死區(qū)室壁厚度與BMSCs組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)免疫組化和Western-blot示各細(xì)胞移植組與PBS組比較，梗死區(qū)CX43、cTnT、α-SMA、Desmin和Vimentin表達(dá)水平升高(P＜0.05或P＜0.01)，其中BMSCs miR-1組均較其他細(xì)胞移植組表達(dá)增加(P＜0.05);而Western-blot

15、示BMSCs miR-1組梗死區(qū)Dll-1、Hes-1較其他組表達(dá)下降(P＜0.05或P＜0.01)。(5)激光共聚焦顯示移植BMSCsmiR-1組在梗死區(qū)的細(xì)胞存活率及向心肌細(xì)胞分化率較BMSCsnull組升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)移植轉(zhuǎn)染miR-1的BMSCs至梗死區(qū)可提高移植的BMSCs存活率及向心肌細(xì)胞分化率，減少心肌梗死面積，增加心室壁厚度，改善心功能;(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-1能下調(diào)梗死區(qū)Dll-1