體外模擬心臟微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：探討成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)、大鼠乳鼠心肌細胞、心臟成纖維細胞在體外分離、培養(yǎng)的方法及大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的標記方法；觀察骨髓間充質(zhì)干細胞、大鼠乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞的生物學特性；探討心肌微環(huán)境中與誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化相關(guān)的因素，為MSCs在心肌梗死類疾病中的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法：提取成年大鼠骨髓全骨髓培養(yǎng)法通過多次傳代獲取純化的MSCs，經(jīng)DAPI標記后分別與經(jīng)胰蛋自酶順

2、序消化法及差速貼壁法獲得的新生大鼠心肌組織內(nèi)的心肌細胞和成纖維細胞體外共培養(yǎng)，同時分別收集心肌細胞和成纖維細胞培養(yǎng)上清液來制備條件培養(yǎng)液并作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs用以模擬心肌內(nèi)微環(huán)境的不同成份對MSCs的作用。通過相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，熒光顯微鏡觀察DAPI標記MSCs的效果，免疫熒光法分析共培養(yǎng)及條件培養(yǎng)后MSCs的心肌特異性抗原(肌肌鈣蛋白)的表達以鑒定其向心肌樣細胞分化情況。 結(jié)果：全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干

3、細胞純度高、細胞增殖能力強、細胞均一性較好。DAPI標記的MSCs熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的藍色熒光，標記率幾乎100％，持續(xù)1周仍明顯可見。培養(yǎng)的心肌細胞純度達70-80％，貼壁生長良好培養(yǎng)，第3天就開始自發(fā)搏動，可持續(xù)2周。心臟成纖維細胞體外培養(yǎng)生長良好。心肌細胞直接接觸共培養(yǎng)的MSCS有一部分表達心肌特異性肌鈣蛋白T，而在其他培養(yǎng)條件下未發(fā)現(xiàn)MSCS表達心肌特異性肌鈣蛋白T。 結(jié)論：全骨髓培養(yǎng)法是一種簡便易行、有效分離骨髓間充