柑橘褐斑病菌比較基因組和轉(zhuǎn)錄組分析及柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢中心調(diào)控途徑和高滲甘油途徑的功能基因研究.pdf

1、一、柑橘褐斑病菌比較基因組和轉(zhuǎn)錄組分析
　　柑橘褐斑病(Alternaria brown spot，ABS)是部分重要橘，以及這些橘和柚或橘和橙雜交柑橘上的重要病害，引起落葉、落果、枯梢，帶病果實(shí)無(wú)法鮮銷，常給感病的柑橘品種生產(chǎn)帶來(lái)巨大困難。柑橘褐斑病的病原為交鏈格孢菌橘致病型(A.alternata pathotype tangerine，也稱A.alternata pv.citri)，已有的研究發(fā)現(xiàn)該病原菌能夠產(chǎn)生寄主選擇性A

2、CT毒素，而該毒素是病菌致病所必需的;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)活性氧解毒系統(tǒng)在病菌致病中也有重要的作用。然而，目前對(duì)柑橘褐斑病菌毒素的合成和調(diào)控過(guò)程以及抗氧化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍缺乏深入的認(rèn)識(shí)，對(duì)該病菌的基礎(chǔ)代謝過(guò)程，如生長(zhǎng)和繁殖，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)以及次生代謝物產(chǎn)生等方面的研究也很少。深入研究柑橘褐斑病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、適應(yīng)、次生代謝等基礎(chǔ)生物學(xué)以及致病機(jī)理可為探索全新病害防治途徑，改善現(xiàn)有防治策略提供新的思路，而一個(gè)完整的基因組信息是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ)。因此

3、，我們對(duì)一個(gè)來(lái)自浙江甌柑的柑橘褐斑病菌菌株Z7進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并與已知其他鏈格孢菌的基因組序列進(jìn)行了比較，同時(shí)還分析了H2O2處理后的轉(zhuǎn)錄組變化，得到以下結(jié)果:
　　1.比較基因組學(xué)研究揭示了柑橘褐斑病菌橘致病型的特異基因
　　柑橘褐斑病菌Z7菌株基因組包含161個(gè)contigs，總長(zhǎng)34.41Mb，平均G+C含量為51.0％。Z7基因組共編碼12062個(gè)基因和115個(gè)tRNA，平均基因長(zhǎng)度1726bp，序列重復(fù)率為0.

4、55％。通過(guò)不同致病型交鏈格孢菌株直系同源基因的分類與比較，得到10個(gè)橘致病型特有的基因。這些基因成簇聚集在基因組上，后續(xù)分析認(rèn)為它們是合成ACT毒素的關(guān)鍵組分，決定了柑橘致病型的分化?；蚪M水平上構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與Lawrence等提出的鏈格孢屬下劃分4個(gè)組的觀點(diǎn)相吻合，為鏈格孢屬真菌新分類系統(tǒng)提供了強(qiáng)有力的支撐。交鏈格孢菌橘致病型基因組中發(fā)現(xiàn)了18個(gè)次生代謝基因簇，其中柑橘專化性相關(guān)的ACT毒素基因簇長(zhǎng)91.2kb，包括25個(gè)基因，

5、大部分基因在基因組中都有2～3個(gè)拷貝，推測(cè)在進(jìn)化過(guò)程中這些基因發(fā)生了復(fù)制，也暗示Z7具有較強(qiáng)的產(chǎn)生ACT毒素的能力。柑橘褐斑病菌含有較多的細(xì)胞壁降解酶，這與它們死體營(yíng)養(yǎng)的生活方式相一致。
　　2.比較基因組揭示柑橘褐斑病菌非必需染色體起源于鏈格孢菌的祖先
　　我們用比較基因組的方法，獲得了Z7總長(zhǎng)1.88Mb的非必需染色體(Conditionally Dispensable Chromosome，CDC)序列。CDC和EC基

6、因組的組成結(jié)構(gòu)具有明顯的不同，CDC的平均G+C含量是47.7％，序列重復(fù)率為1.23％;Z7CDC編碼525個(gè)蛋白，不含有tRNA。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)CDC上的基因主要富集在‘細(xì)胞代謝過(guò)程’、‘初級(jí)代謝過(guò)程’、‘氧化還原反應(yīng)’和‘大分子代謝過(guò)程’等生物學(xué)過(guò)程。蛋白家族分析表明CDC上含有13個(gè)碳水化合物酶，29個(gè)分泌蛋白，3個(gè)激酶，21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，25個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和13個(gè)細(xì)胞色素P450單加氧酶。密碼子適應(yīng)性指數(shù)(CAI)分析表明E

7、C和CDC基因的密碼子偏好性明顯不同，暗示CDC的進(jìn)化歷史可能與EC不同。通過(guò)Ka/Ks分析發(fā)現(xiàn)，CDC上的基因都受到強(qiáng)烈的純化選擇。直系同源聚類發(fā)現(xiàn)接近77％的CDC基因的同源基因至少在5個(gè)其他鏈格孢菌種中出現(xiàn)，通過(guò)比較由24個(gè)鏈格孢菌屬蛋白和29個(gè)其他真菌屬的蛋白組成的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，超過(guò)95％的CDC基因都與鏈格孢菌數(shù)據(jù)庫(kù)具有較高的相似性，表明CDC上絕大多數(shù)基因來(lái)自于鏈格孢屬真菌的祖先。
　　3.線粒體比較基因組揭示柑橘褐斑病

8、菌與其他種屬線粒體的保守基因在排布上顯示巨大差異
　　柑橘褐斑病菌線粒體基因組大小50，625bp，平均A+T含量為70.8％，含有13個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白基因，2個(gè)核糖體大小亞基和31個(gè)tRNA，線粒體基因組編碼效率為63.7％，整體表現(xiàn)出偏好使用富含A/T的密碼子。腔菌目(Pleosporales)三個(gè)菌株線粒體基因組的基因較為保守，但基因的排布則表現(xiàn)出巨大的差異，暗示它們進(jìn)化歷史不同。用線粒體蛋白構(gòu)建的不同物種系統(tǒng)進(jìn)化樹與核基因組構(gòu)

9、建的進(jìn)化樹一致，說(shuō)明雖然線粒體基因相對(duì)基因組基因進(jìn)化速度較快，但總體上與物種進(jìn)化趨勢(shì)吻合。不同真菌線粒體內(nèi)基因組內(nèi)含子及基因間區(qū)存在多樣性，是造成線粒體大小差異的重要原因。
　　4.轉(zhuǎn)錄組分析揭示谷胱甘肽系統(tǒng)、過(guò)氧化物酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因家族在H2O2脅迫適應(yīng)中發(fā)揮重要作用
　　通過(guò)對(duì)柑橘褐斑病菌在H2O2處理30min后其轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化分析，發(fā)現(xiàn)1108個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和498個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。差異表達(dá)的基因主要富集在細(xì)胞代謝、

10、氧化還原和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程。谷胱甘肽系統(tǒng)、硫氧還蛋白、過(guò)氧化氫酶、半胱氨酸過(guò)氧化物氧化還原酶等可能是該病菌清除H2O2的主要成員。此外，我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、激酶家族、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450、泛素和熱激蛋白等在柑橘褐斑病菌H2O2脅迫適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在非必需染色體上也有29個(gè)基因受到H2O2的明顯誘導(dǎo)，其中包括ACT毒素合成的關(guān)鍵基因聚酮合成酶CDCn|11750。
　　二、柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢中心調(diào)控途徑和高滲甘油途徑的功能

11、基因研究
　　柑橘綠霉病(Penicillium digitatum)是柑橘貯藏、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)中的主要問題，在我國(guó)每年因綠霉病導(dǎo)致柑橘損失高達(dá)數(shù)百萬(wàn)噸。迄今，已有3個(gè)柑橘綠霉病菌菌株的全基因組公布，但對(duì)該病菌的生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)和致病等的分子機(jī)制了解甚少。形成大量的分生孢子是構(gòu)成病害流行的基礎(chǔ)，而抵抗適應(yīng)高滲透勢(shì)等逆境脅迫條件是病菌賴以寄生高糖柑橘果實(shí)的必要基礎(chǔ)。為了解柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢和對(duì)滲透勢(shì)的適應(yīng)機(jī)制，本文研究了該病菌的brlA

12、、abA和wetA3個(gè)產(chǎn)孢中心調(diào)控基因和雙組份組氨酸激酶基因os2的生物學(xué)功能，取得如下結(jié)果:
　　1.PdbrlA、PdabA和PdwetA調(diào)控柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢的不同階段
　　病菌繁殖產(chǎn)生的大量無(wú)性孢子是綠霉病菌病賴以傳播擴(kuò)散的必要條件。brlA、abaA和wetA是調(diào)節(jié)分生孢子形成的重要元件。柑橘綠霉病菌中PdbrlA敲除突變體完全喪失了形成分生孢子梗的能力;PdabaA敲除突變體雖能形成分生孢子梗，但所形成的分生孢子梗

13、畸形，不具有產(chǎn)孢能力;PdwetA的缺失突變體能夠形成正常的分生孢子梗，也可以產(chǎn)孢，但分生孢子的細(xì)胞壁明顯疏松，加厚，分生孢子色素不沉積，分生孢子萌發(fā)延遲，病菌對(duì)滲透脅迫，去垢劑和熱激反應(yīng)的耐受性明顯下降，但對(duì)H2O2的耐受性卻變強(qiáng)。qRT-PCR結(jié)果表明綠霉菌中存在PdbrlA→PdabA→ PdwetA級(jí)聯(lián)調(diào)控模式，而且這種模式可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制?；虮磉_(dá)譜分析結(jié)果表明:與野生型相比，缺失突變體中的401個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，144個(gè)

14、基因上調(diào)表達(dá)。Go富集表明下調(diào)表達(dá)的基因功能主要富集在細(xì)胞膜完整性，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和碳水化合物活性等方面，上調(diào)的基因主要參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程。KEGG分析預(yù)測(cè)PdbrlA與淀粉和蔗糖代謝途徑有關(guān)。根據(jù)煙曲霉和構(gòu)巢曲霉中產(chǎn)孢相關(guān)基因的報(bào)道，我們?cè)诰G霉菌中找到了39個(gè)與產(chǎn)孢相關(guān)的同源基因。其中，12個(gè)基因(abr1、alb1、arp1、arp2、ayg1、asp f4、rodA、rod、ppoC、axl2、abaA和wetA)在PdbrlA中表達(dá)

15、明顯下調(diào)，2個(gè)基因(flbA和fibB)表達(dá)明顯上升，12個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因啟動(dòng)子區(qū)都具有brlA和abaA的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.柑橘綠霉病菌通過(guò)Pdos2正調(diào)控甘油含量、負(fù)調(diào)控甾醇含量適應(yīng)高鹽環(huán)境
　　高滲甘油途徑在真核生物體內(nèi)廣泛存在，對(duì)機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化具有極其重要的作用。Os2是該途徑的一個(gè)重要激酶，柑橘綠霉病菌△Pdos2突變體對(duì)NaCl滲透壓和細(xì)胞壁干擾制劑剛果紅和十二烷基苯磺酸鈉的敏感性顯著上升，對(duì)氟咯菌腈和異

16、菌脲兩種殺菌劑的抗性也有部分提高，表明Pdos2參與了高滲透脅迫適應(yīng)、細(xì)胞壁完整性和藥劑抗性等生命過(guò)程。然而突變體對(duì)由H2O2引起的氧化壓的敏感性并沒有明顯改變?！鱌dos2突變體在接種4天后引起的病斑大小相比野生型減少了約25％，表明Pdos2對(duì)維持柑橘綠霉病菌的致病性起到部分作用。0.7M NaCl處理后，野生型菌絲體內(nèi)甘油的含量明顯提高而麥角甾醇的含量卻顯著降低。△Pdos2突變體菌絲內(nèi)的甘油含量?jī)H有輕微地上升，而麥角甾醇的含量保