柑橘綠霉病菌比較基因組及抗DMI殺菌劑機(jī)理研究.pdf

1、我國(guó)是世界上柑橘種植和消費(fèi)的主要大國(guó)之一，柑橘年產(chǎn)量超過千萬噸。柑橘綠霉病一直以來是困擾柑橘儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)的主要問題。在我國(guó)，每年因綠霉病導(dǎo)致的柑橘產(chǎn)量損失高達(dá)百萬噸。目前對(duì)柑橘綠霉病的防治手段捉襟見肘，病菌抗藥性產(chǎn)生的速率遠(yuǎn)超藥劑更替的速率，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全帶造成了嚴(yán)重的威脅。然而，由于對(duì)病菌的侵染過程和殺菌劑作用機(jī)理缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，如何有效提高病害的防治效果，同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的傷害是我們目前所面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究在此背景下，通過

2、對(duì)柑橘綠霉病菌的全基因組測(cè)序，系統(tǒng)了解了病菌的遺傳組成，同時(shí)在獲得基因組信息的基礎(chǔ)上，闡明了我國(guó)柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑主要菌群的抗性調(diào)控機(jī)理。研究結(jié)果如下:
　　1.柑橘綠霉病菌基因組測(cè)序揭示大量次生代謝及細(xì)胞壁水解酶等基因家族的丟失
　　通過全基因組測(cè)序，我們獲得了約26Mb的柑橘綠霉病菌基因組序列，包含103個(gè)scaffold。該基因組共編碼約9，000個(gè)蛋白和162個(gè)tRNA。重復(fù)序列約占整個(gè)基因組的1％。通過與其

3、他青霉菌、曲霉菌以及近緣的植物病原真菌比較分析后發(fā)現(xiàn)，柑橘綠霉病菌基因組更為緊湊，編碼相對(duì)較少的基因?；蚪M共線性和蛋白家族進(jìn)化分析顯示，柑橘綠霉病菌有100多個(gè)家族發(fā)生了明顯的縮減，僅有兩個(gè)家族發(fā)生了擴(kuò)增。通過對(duì)次生代謝物合成基因簇的預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中丟失了大部分毒素合成基因簇的關(guān)鍵合成基因，僅保留了一個(gè)完整的tryptoquialanine合成基因簇，這一結(jié)果解釋了前人研究發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌毒素合成能力較弱的現(xiàn)象，同時(shí)也預(yù)示

4、毒素跟病菌的致病能力并不相關(guān)。通過碳?xì)浠衔锎x相關(guān)酶的比較發(fā)現(xiàn)，柑橘綠霉病菌丟失了大量的細(xì)胞壁水解酶，這也可能是導(dǎo)致該病菌寄主范圍較窄的原因之一。
　　2.線粒體基因組比較分析顯示柑橘綠霉病菌在進(jìn)化過程丟失了內(nèi)含子
　　通過基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的拼接和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們得到了柑橘綠霉病菌的全長(zhǎng)線粒體基因組，該線粒體基因組大小為28，978bp，平均A+T含量為74.7％，共編碼15個(gè)蛋白，27個(gè)tRNA，以及兩個(gè)核糖體大、小亞基RN

5、A基因。與酵母等物種相比，青霉屬真菌線粒體基因組雖然編碼能力（編碼基因數(shù)）大致相當(dāng)，但其編碼效率較高（80％為編碼序列）。青霉菌和曲霉菌的線粒體基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，這些菌中線粒體基因組的序列和編碼基因的排列都比較保守，其中atp8基因可能受到負(fù)選擇作用。此外，線粒體內(nèi)含子在所比較的幾個(gè)真菌中差異相對(duì)較大，而柑橘綠霉病菌在進(jìn)化過程中可能丟失了一些內(nèi)含子。
　　3.比較轉(zhuǎn)錄組揭示柑橘綠霉病菌在碳源利用及PacC調(diào)控基因方面的差異

6、>　　通過對(duì)柑橘綠霉病菌在柑橘皮和葡萄糖培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)在柑橘皮培養(yǎng)基上有290個(gè)基因發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，而123個(gè)基因發(fā)生了下調(diào)表達(dá)。使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋后發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與一些代謝過程。此外，很多參與碳源利用的基因都發(fā)生了上調(diào)，如木酮糖還原酶，翻轉(zhuǎn)酶，幾丁質(zhì)酶，和β-N乙酰己糖胺酶等。相反，參與氨基酸、核苷酸代謝的這些基因大多都沒有發(fā)生差異表達(dá)。另外，部分細(xì)胞壁水解酶以及tryptoquialan

7、ine的整個(gè)合成基因都發(fā)生了上調(diào)表達(dá)。
　　柑橘綠霉病菌和膠孢炭疽菌都能夠侵染柑橘果實(shí)，然而兩者采取截然不同的策略，前者在侵染的時(shí)候能夠產(chǎn)生有機(jī)酸使環(huán)境酸化，而后者則分泌胺類物質(zhì)使環(huán)境堿化。通過對(duì)這兩個(gè)真菌中PacC突變體的表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸和產(chǎn)堿真菌中PacC的調(diào)控機(jī)理已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的分化，盡管識(shí)別的模體和調(diào)控的基因家族相對(duì)保守，但是對(duì)于特定基因的調(diào)控方式（上調(diào)或下調(diào)）以及表達(dá)量差異明顯，產(chǎn)堿真菌中盡管被抑制的基因和被激

8、活的基因數(shù)目相當(dāng)，但是堿性表達(dá)基因在PacC激活情況下表達(dá)量有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。而產(chǎn)酸真菌中，大量的基因在堿性條件下被抑制表達(dá)，但當(dāng)病菌生長(zhǎng)過程中，環(huán)境pH不斷降低，這些基因?qū)㈥懤m(xù)被激活，從而參與生長(zhǎng)和致病過程。
　　4.PdCYP51B基因的超量表達(dá)是造成柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑的原因
　　在2000年到2010年期間，我們?cè)谡憬≈饕涕佼a(chǎn)區(qū)收集了403個(gè)柑橘綠霉病菌菌株，其中，高達(dá)89％的抗性菌株其抗性機(jī)理不明。為此，我們

9、比較了不同的抗性和敏感菌株，發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中存在另外兩個(gè)相似度較高的CYP51基因，稱之為PdCYP51B和PdCYP51C。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在未知抗性菌株中，PdCYP51B啟動(dòng)子區(qū)都含有一段199bp序列的插入，這個(gè)特征在抑霉唑敏感菌株和已知抗性基因型的菌株中均不存在。將敏感菌株中的PdCYP51B基因轉(zhuǎn)入柑橘綠霉病菌后，突變體的抗藥性增加，而將含有199bp序列插入的PdCYP51B基因轉(zhuǎn)入病菌后，突變體的抗藥性增加更高。說明，1

10、99bp序列的插入造成了PdCYP51B基因的超量表達(dá)，從而賦予了病菌對(duì)藥劑的抗性。
　　5.199bp插入片段是一個(gè)具有轉(zhuǎn)座和啟動(dòng)子活性的微小轉(zhuǎn)座子
　　對(duì)上述199bp插入片段進(jìn)行序列分析，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)TSD(target siteduplication)和一個(gè)TIR(terminal invert repeat)位點(diǎn)。此外，該序列無編碼能力，能夠形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且富含A+T?；谝陨戏治觯覀冋J(rèn)為該199bp屬于

11、微小轉(zhuǎn)座子家族(miniature inverted-repeat transposable element，MITE)，命名為PdMLE1。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和Southern雜交顯示,PdMLE1僅存在于柑橘綠霉病菌中，且拷貝數(shù)較多。GFP融合表達(dá)顯示，PdMLE1能夠啟動(dòng)GFP表達(dá)，且啟動(dòng)子能力較強(qiáng)。通過對(duì)PdMLE1核心啟動(dòng)子序列定位，我們得到了一段20bp的啟動(dòng)子核心區(qū)域，同時(shí)我們也通過類似的方法獲得了PdCYP51B基因原始啟動(dòng)子的