母體血漿中胎兒DNA點突變新型檢測技術(shù)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中價值的研究.pdf

1、背景與目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)在妊娠過程中母體血漿中存在游離胎兒DNA，這一發(fā)現(xiàn)為基于母體外周血的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開辟了新的領(lǐng)域。胎兒DNA一半來自于母親，另一半來自于父親，目前已報道利用母體血漿DNA來檢測胎兒父系來源的致病基因，可應(yīng)用于父親為常染色體顯性遺傳病患者的胎兒無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，而且將這種檢測方法應(yīng)用于父親為常染色體隱性遺傳病攜帶者的產(chǎn)前診斷，也可使50％的胎兒避免了傳統(tǒng)的絨毛吸取或羊膜腔穿刺檢查。但由于母體血漿總DNA量少，且在血

2、漿總DNA中胎兒DNA所占的比例甚微，母體等位DNA片段可干擾胎兒DNA的檢測，因此對這種低豐度胎兒DNA檢測必須采用高靈敏度和高特異性的分析系統(tǒng)。點突變或單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)的檢測是目前DNA分子診斷中的主要研究內(nèi)容，對母體血漿中的這些單核苷酸差異的檢測在技術(shù)上要求更高，目前所用的檢測方法仍不夠理想。DNA連接酶對單個核苷酸差異具有很強的鑒別能力，其核心在于它可以把與模板完

3、全配對的兩相鄰寡核苷酸片段連接起來，如果連接處出現(xiàn)一個堿基錯配，連接反應(yīng)就不能進行。以該酶為基礎(chǔ)的技術(shù)如空隙-連接酶鏈反應(yīng)(gapligasechainreaction，Gap-LCR)和連接酶檢測反應(yīng)(1igasedetectionreaction，LDR)在低豐度基因單核苷酸差異檢測方面具有很強的應(yīng)用潛力。因此本研究擬以β地中海貧血的常見突變和雌激素受體α的SNP位點(c.454-397T＞C)作為研究對象，在Gap-LCR或LDR

4、技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光定量PCR、毛細管電泳和納米金新型通用型芯片來檢測低豐度基因的單核苷酸差異，探索檢測母體血漿中胎兒父系來源DNA點突變的新方法，為胎兒遺傳性疾病的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷尋求新的有效途徑。 主要方法與結(jié)果如下： 第一部分：母體血漿DNA實驗?zāi)Ｐ偷慕?1.用反向斑點雜交技術(shù)檢測β地中海貧血ⅣS-Ⅱ-654(C→T)、CD17(A→T)、CD26(G→A)、CD41-42(-CTTT)和CD71-72(

5、+A)突變的外周血標本，然后進行DNA序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反向斑點雜交技術(shù)在突變位點周圍存在SNP時可造成誤診。 2.利用pVUⅡ限制酶酶切方法鑒定雌激素受體α基因SNP(c.454-397T＞C)分型，并進行DNA序列分析，結(jié)果表明，酶切鑒定結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。 3.根據(jù)母體血漿中母體DNA和胎兒DNA的比例，利用上述的基因突變和SNP分型檢測結(jié)果，將不同比例含檢測突變/SNP的DNA和未含該突變/SNP的DNA混合

6、，模擬母體血漿DNA實驗?zāi)Ｐ?，有利于更好地研究母體血漿中胎兒DNA單核苷酸差異檢測方法的特異性和靈敏度。 第二部分：Gap-LCR結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)在低豐度DNA點突變檢測中的應(yīng)用研究 1.為了更靈敏地檢測連接產(chǎn)物，本實驗對其中一對LCR引物進行修飾，分別于上游引物的5'端和下游引物的3’端加入一段特異的序列，以此作為熒光定量PCR的識別序列，進行熒光定量PCR檢測。采用Gap-LCR技術(shù)特異性識別突變位點，若樣本存

7、在要檢測的突變，則產(chǎn)生連接產(chǎn)物，然后利用定量PCR技術(shù)對連接產(chǎn)物進行檢測，就可達到檢測低豐度DNA點突變的目的。 2.將20pg和2ng的CD17突變雜合子DNA標本分別進行15、20、25、30個循環(huán)的LCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著循環(huán)數(shù)增加，其產(chǎn)物量也相應(yīng)地增加，并提示用來檢測母體血漿DNA標本時循環(huán)數(shù)可在20～25個之間進行選擇。而利用200ng的正常DNA標本進行同樣的循環(huán)梯度LCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管在LCR擴增過程中也可出現(xiàn)非特異性

8、產(chǎn)物，但產(chǎn)物量明顯低于20pgCD17突變雜合子DNA標本相應(yīng)循環(huán)數(shù)的產(chǎn)物量，由此提示，此方法用于低豐度DNA點突變的檢測具有很高的靈敏度和較好的特異性。 3.利用Gap-LCR結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)檢測含不同濃度CD17突變的DNA標本：將含20pg、200pg、2nng、20ngCD17突變雜合子的DNA標本分別進行25個循環(huán)的Gap-LCR，結(jié)果表明，LCR起始模板量的增加10倍，其產(chǎn)物量大約增加10倍，由此提示，此方法具

9、有較好的定量特性。 4.將含20pg或200pgCD17突變雜合子的DNA分別與1ng、10ng、100ng的正常DNA混合，作為LCR的模板。后分別利用Taqman探針法和SYBRGreenI染料法定量檢測LCR產(chǎn)物，結(jié)果表明，不同濃度背景DNA下的CD17突變DNALCR產(chǎn)物數(shù)量基本一致，由此提示該技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度可達到1∶10000(突變DNA序列與正常DNA序列之比)。 第三部分：PCR/LDR

10、結(jié)合毛細管電泳技術(shù)在母體血漿中胎兒DNA單核苷酸差異檢測中的應(yīng)用研究 1.首先利用PCR技術(shù)擴增靶序列，然后以擴增產(chǎn)物為模板，用LDR技術(shù)特異地識別突變，其中LDR的一側(cè)引物用熒光標記，最后用毛細管電泳技術(shù)來檢測連接產(chǎn)物。 2.DNA連接酶不同用量的LDR實驗發(fā)現(xiàn)，同一DNA連接酶用量對不同錯配堿基對的識別能力不同，而過量使用DNA連接酶可出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，由此提示，DNA連接酶使用量與連接反應(yīng)的保真性有關(guān)。 3

11、.PCR/LDR/毛細管電泳方法的靈敏度檢測及母體血漿DNA實驗?zāi)Ｐ偷臋z測結(jié)果顯示，該技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度可達到1∶10000。 4.抽取15-24周的孕婦外周血，利用pVUⅡ限制酶酶切方法鑒定25例孕婦的ERα基因SNP(c.454-397T＞C)分型，其中13例為純合子。提取母體血漿DNA后，利用PCR/LDR結(jié)合毛細管電泳技術(shù)進行檢測，結(jié)果與臍帶血鑒定的新生兒的基因分型一致。 第四部分：PCR/LDR

12、結(jié)合納米金新型通用型芯片技術(shù)的建立及其在低豐度DNA點突變檢測中的應(yīng)用研究 1.首先利用PCR技術(shù)擴增靶序列，以擴增產(chǎn)物為模板，用LDR技術(shù)特異地識別突變，其中在LDR的上游引物的5’端連上標簽(tag)序列，下游引物的3’端用生物素標記，然后將5’端有tag序列和3’端有生物素標記的連接產(chǎn)物與通用型芯片上的anti-tag序列(與tag互補的序列)進行雜交，接著用鏈霉親和素修飾的納米金作為第二反應(yīng)物，與在芯片上雜交的連接產(chǎn)物以

13、生物素-鏈霉親和素反應(yīng)的方式相結(jié)合，經(jīng)銀顯影液放大后用普通CCD觀察結(jié)果。 2.PCR/LDR結(jié)合納米金新型通用型芯片技術(shù)的靈敏度檢測及母體血漿DNA實驗?zāi)Ｐ偷臋z測結(jié)果表明，該技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度可達到1∶1000，而化學(xué)發(fā)光法用于芯片信號檢測的靈敏度為1∶500。 結(jié)論： 1.將Gap-LCR和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，成功地建立了一種高靈敏度的低豐度基因點突變檢測技術(shù)，可用于母體血漿或血清中胎兒

14、DNA點突變檢測，同時可以對胎兒DNA進行定量，有望成為基于母體血漿中胎兒DNA的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷和妊娠期相關(guān)疾病預(yù)測的新手段，同時也可在腫瘤的早期診斷等其它低豐度基因突變檢測領(lǐng)域中應(yīng)用，但由于需要兩次指數(shù)擴增，在操作過程中必須防止擴增污染。 2.PCR/LDR結(jié)合毛細管電泳技術(shù)用于低豐度基因單核苷酸差異檢測也具有很高的靈敏度，可應(yīng)用于母體血漿中胎兒DNA點突變/SNP的檢測。由于PCR/LDR僅涉及到一次指數(shù)擴增，而且因為LDR

15、為線性擴增，即使在LDR過程中出現(xiàn)錯配現(xiàn)象，也不會影響到后續(xù)的擴增。與Gap-LCR結(jié)合熒光定量PCR的技術(shù)比較，其特異性高，而且擴增污染的可能性明顯減小，顯然具有臨床實用價值，將大大拓展母體血漿中胎兒DNA在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用范圍。 3.PCR/LDR結(jié)合通用型芯片技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度較前面的技術(shù)低，但可大幅度提高標本的檢測通量，且用納米金作為芯片信號報告分子，可達到母體血漿中胎兒父系來源的DNA點突變/SN