母體血漿中胎兒游離mRNA等位基因比率分析——用于21三體綜合征無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查的研究.pdf

1、21三體綜合征是常見的染色體非整倍疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為智力低下，多器官發(fā)育及功能異常，典型的面部特征等。其產(chǎn)前篩查及診斷作為產(chǎn)科醫(yī)務工作者的重點研究內(nèi)容。目前染色體核型分析技術仍然是產(chǎn)前診斷21－三體綜合征胎兒的金標準[1]，但需要采用有創(chuàng)傷性的方法獲取胎兒細胞，如羊水穿刺、臍血穿刺或者獲取絨毛組織，給孕婦及家屬帶來很多顧慮，不易被接受。近年來研究顯示[2-4]，母體外周血中存在胎兒游離核酸，這為無創(chuàng)性篩查胎兒染色體非整倍體異常提供

2、了新途徑。Poon等[5]研究發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血血漿中來源于胎盤的胎兒特異性表達的PLAC4基因所編碼的mRNA，為胎兒游離mRNA用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查21三體綜合征提供了依據(jù)。MLPA-SNP技術是近年來產(chǎn)前篩查21三體綜合征的新技術[6]，運用母體外周血中胎兒特異的mRNA上的等位基因的多態(tài)性，對21三體綜合征進行產(chǎn)前篩查。本研究通過DNA測序技術及PCR-RFLP技術，分析河南地區(qū)漢族人群21號染色體上PLAC4和COL6A2基因的10

3、個SNP位點的基因型，篩選適合本地區(qū)人群的高雜合率SNP位點；檢測孕8-16周孕婦外周血中的胎兒特異基因PLAC4和COL6A2 mRNA的表達量，分析無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查的適宜孕周；選取該地區(qū)5個高雜合率SNP位點，采用RT-MLPA技術對40例標本進行檢測。
　　目的：
　　本研究通過分析中國河南地區(qū)漢族人群中21號染色體上PLAC4和COL6A2基因的多個單核苷酸多態(tài)性的特點，及胎兒游離mRNA在不同孕周的母體外周血中的表達

4、水平。探討逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴增技術用于該地區(qū)21三體綜合征胎兒的無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查的價值。
　　材料和方法：
　　1.實驗材料
　?、俚谝徊糠郑弘S機選取2013年6月至12月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院體檢門診體檢的患者500例，男女各250例，滿足條件：籍貫河南省，漢族，既往體健，簽署知情同意書后，留取其2mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管作為標本。
　?、诘诙糠郑弘S機選取門診30例圍產(chǎn)保健的健康孕婦，簽署知情同意書

5、后，分別在其懷孕8周、10周、12周、14周、16周，留取5mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管作為標本。
　?、鄣谌糠郑哼x取我院羊水胎兒細胞染色體核型分析結果為21三體綜合征陽性的孕婦20例為實驗組，正常妊娠孕婦20例作為陰性對照組，告知并簽署知情同意書后，留取其5mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管作為標本。
　　2.實驗方法
　　①第一部分：運用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性技術和DNA測序技術，檢測500例河南地

6、區(qū)漢族人群中胎兒特異性基因PLAC4和COL6A2基因上10個SNP位點的基因型，計算其等位基因的雜合率；
　?、诘诙糠郑哼\用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應技術，測定30例孕婦在孕8周、10周、12周、14周、16周時的外周血中胎兒游離的PLAC4和COL6A2兩種mRNA在5個不同孕周期的表達水平；
　?、鄣谌糠郑哼\用逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴增技術對羊水胎兒細胞染色體核型分析結果為21三體綜合征陽性的孕婦20例及正常妊

7、娠孕婦20例，進行21三體綜合征胎兒的無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查。
　　結果：
　　1.第一部分500例河南地區(qū)漢族人群中胎兒特異性基因上10個SNP位點雜合率分別為
　　1）PLAC4基因：rs59066201（61.6％）、rs8130833（39.2%）、rs4818219（34.8%）、rs9977003（21.6%）、rs7844（19.2%）；
　　2）COL6A2基因：rs7717（49.6%）、rs10445

8、98（53.4%）、rs559（50.2%）、rs3088026（12.8%）、rs1042917（45.6%）：
　　3）rs59066201等位基因雜合率在NCBI數(shù)據(jù)庫上未見報道；與NCBI數(shù)據(jù)庫報道相比較，rs8130833、rs9977003、rs7844位點等位基因雜合率有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其他位點無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　2.第二部分30例孕婦在孕8周、10周、12周、14周、16周時的外周

9、血中均能檢測到胎兒游離mRNA，表達量隨孕周的增加而增加
　　1）PLAC4 mRNA在5個孕周的表達水平依次為：7.22±1.05、8.02±1.41、9.51±1.69、11.33±2.11、13.31±2.58；
　　2）COL6A2 mRNA在5個孕周的表達水平依次為8.95±1.28、11.19±1.36、15.0±1.58、16.87±1.72、18.96±2.79。
　　3.第三部分選取5個雜合率比較高的

10、SNP位點，采用RT-MLPA技術進行21三體綜合征的產(chǎn)前篩查
　　rs7717、rs559、rs1044598、rs59066201、rs1042917，在河南地區(qū)人群覆蓋率達到[[1-（1-49.6%）×（1-53.4%）×（1-50.2%）×（1-61.6%）×（1-45.6%）]=97.6%]，對20例21三體綜合征胎兒孕婦及20例正常胎兒孕婦外周血標本進行21三體綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查，有效篩查率達到87.5%，篩查準確

11、率達到100%。
　　結論：
　　1．本研究中的10個SNP位點中，rs7717、rs559、rs1044598、rs59066201、rs1042917位點的雜合率較高，人群覆蓋率達到97.6%，可用于河南地區(qū)漢族人群21三體綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查；
　　2．胎兒特異性基因PLAC4和COL6A2 mRNA在孕婦外周血中均有表達，當胎兒特異性mRNA-SNP位點呈雜合狀態(tài)時，運用RT-MLPA技術可以在孕8-16周進