課件：基于高通量測(cè)序的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷

1、基于高通量測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷,殷志明,上海市細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心有限公司,,染色體非整倍體簡介無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)背景介紹無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)方法學(xué)介紹1. 大規(guī)模并行測(cè)序法 （BGI, BerryGenomics等）2. 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增測(cè)序法 （Natera，公司）小結(jié),染色體疾?。?染色體疾病是染色體遺傳病的簡稱。主要是指由于染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常引起的疾病。其中最為常見的是21三體綜合征（T21）、18三體綜合征（T18）

2、、13三體綜合征（T13）三大染色體疾病。染色體疾病患兒多表現(xiàn)為智力低下、生長發(fā)育遲緩等，目前無有效治療手段，由此給社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對(duì)家庭造成的心理負(fù)擔(dān)和精神痛苦更是無法用金錢來衡量。,出生缺陷的社會(huì)壓力,金標(biāo)準(zhǔn)：核型分析,基于高通量測(cè)序的產(chǎn)前診斷,外周血腫瘤游離DNA,,孕婦外周血胎兒游離DNA,2024/4/4,2024/4/4,,游離DNA的發(fā)現(xiàn),高通量測(cè)序-定量-定性,無創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷,2024/4/4,基于高通量測(cè)序的

3、產(chǎn)前診斷,1.全基因組低覆蓋度測(cè)序2.目標(biāo)區(qū)域測(cè)序-基因分型,2024/4/4,,數(shù)據(jù)分析：Base Calling以后得到36bp的短片段利用Pipeline軟件比對(duì)每條短片段分別屬于幾號(hào)染色體統(tǒng)計(jì)各條染色體的讀段數(shù)，計(jì)算21號(hào)染色體（胎兒+母體）在所有染色體讀段數(shù)中所占的比例 利用SigmaStat統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算得出診斷結(jié)果,無創(chuàng)方法學(xué)示意,2024/4/4,發(fā)表的無創(chuàng)產(chǎn)前文章,證明性研究Chiu RSparks A

4、et al,AJOG,2008 WK et al,Proc Nati Acad Sci,2008Fan Hc et al, Nati Acad Sci,2008Chiu RWK et al,Clin Chem,2010Sehnert AJ et al,Clin Chem,2011大規(guī)模驗(yàn)證性研究Chiu RWK et al, BMJ,2011Ehrich M et al,AJOG,2011Palomaki GE et a

5、l, Genet Med 2011Bianchi DW et al,Obstet Gynecol 2012Norton ME et al,AJOG,2012,2024/4/4,大規(guī)模平行測(cè)序法-關(guān)鍵點(diǎn)-文獻(xiàn)解讀,1.游離DNA的提取-建庫2.多少覆蓋度的測(cè)序才能將非整倍體準(zhǔn)確分離3.胎兒游離DNA在母血中所占的比例4.測(cè)序的gc 偏向性5.需要的陰性樣本質(zhì)控量6.在不同的平臺(tái)上的實(shí)現(xiàn)（illumina-life

6、),2024/4/4,游離DNA的提取-建庫,,將游離DNA最大程度的提取,2024/4/4,測(cè)序所需的reads數(shù),,成本,準(zhǔn)確度,2024/4/4,胎兒游離DNA在母血中所占的比例,,real Depth coverage,Ideal Depth coverage,GC-bias,sequencing biases in GC-rich and GC-poor regions with high-throughput s

7、equencing technologies,,gc矯正法的流程,50kb切割基因組,計(jì)算50kb內(nèi)gc%含量,計(jì)算50kb內(nèi)的reads數(shù),Loess 標(biāo)準(zhǔn)化處理,計(jì)算校正后的reads數(shù),計(jì)算校正后的z值,,,,,2024/4/4,,gc校正的效果,2024/4/4,需要多少陰性樣本庫做質(zhì)控？,After 100,sd of GR is becoming stable,2024/4/4,可改進(jìn)的方向：,1.富集胎兒游離DNA

8、2.改善基因組擴(kuò)增不均一性3.精確定量cfDNA的含量,2024/4/4,基于目標(biāo)區(qū)域的基因分型方法,2024/4/4,基于目標(biāo)區(qū)域的基因分型方法,10000多個(gè)SNP位點(diǎn),多重pcr,目標(biāo)區(qū)域測(cè)序,2024/4/4,,構(gòu)造了一個(gè)貝葉斯推斷模型,基于目標(biāo)區(qū)域的基因分型方法,2024/4/4,為何需要低風(fēng)險(xiǎn)的研究？,目前的研究主要是集中于高風(fēng)險(xiǎn)的婦女。胎兒循環(huán)DNA的含量在這部分人群中的含量是比較高的。因此這種檢驗(yàn)的方法對(duì)低

9、風(fēng)險(xiǎn)的婦女是不夠健壯的。,2024/4/4,為何需要低風(fēng)險(xiǎn)研究？？,我們知道我們知道有些事情，我們知道我們不知道有些事情，也有一些事情，我們不知道我們不知道,2024/4/4,未來：胎兒全基因組測(cè)序,無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的延伸,2024/4/4,未來：胎兒全基因組測(cè)序,2024/4/4,觀察狀態(tài),隱藏狀態(tài),隱馬科夫模型（hidden makov model),無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的另一個(gè)方向,32,,無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的另一個(gè)方向,2024/4/4,