皺瘤海鞘抗單純皰疹病毒Ⅱ型活性及作用機制研究.pdf

1、海鞘(Ascidian)是尾索動物亞門(Uro-chordata)海鞘綱(Ascidiacea)的尾索動物,主要分布在熱帶及亞熱帶海域,海鞘中含有許多有生理活性的化合物,這些活性化合物有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等作用。皺瘤海鞘Styela plicata在我國南海有大量分布,研究皺瘤海鞘的藥用價值,對開發(fā)利用我國的這一豐富資源具有一定的現(xiàn)實意義。
　　 目的：課題組前期研究發(fā)現(xiàn)皺瘤海鞘在體內(nèi)外對乙型肝炎病毒(HBV)都有一定的抑制作

2、用,顯示出良好的研究和開發(fā)前景。因此,本課題擬對皺瘤海鞘對同是具有包膜的DNA病毒單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)藥效活性和作用機制進行研究。為進一步了解皺瘤海鞘的抗病毒譜,為新型抗病毒藥物的研究和開發(fā)提供理論依據(jù),為皺瘤海鞘的進一步深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.皺瘤海鞘體外抗HSV-2藥效學(xué)研究運用HSV-2在非州綠猴腎細胞(Vero細胞)上的增殖模型,通過觀察細胞病變(CPE法)和四甲

3、基偶氮唑鹽比色法(MTT比色法)檢測細胞活性,以病毒抑制率和治療指數(shù)(TI)為指標對皺瘤海鞘體外抗HSV-2的藥效活性作用進行評價。
　　 2.皺瘤海鞘體外抗HSV-2病毒作用機制研究運用HSV-2在Vero細胞上的增殖模型,在HSV-2復(fù)制的不同階段用藥物進行干預(yù),運用CPE法結(jié)合MTT比色法檢測細胞存活率,以病毒抑制率和TI為指標考察了藥物在體外對HSV-2病毒直接殺傷作用、對HSV-2吸附的阻斷作用、對HSV-2病毒生物合

4、成的抑制作用和在不同時間點加入藥物對HSV-2復(fù)制的抑制作用；運用熒光定量PCR方法,從分子水平上探討了皺瘤海鞘對HSV-2DNA雙鏈復(fù)制的影響；運用RT-PCR方法進一步研究皺瘤海鞘對HSV-2DNA聚合酶基因表達的影響。
　　 3.皺瘤海鞘對陰道感染HSV-2小鼠的保護作用運用小鼠陰道感染HSV-2的致病模型,研究了皺瘤海鞘對小鼠生殖器皰疹的治療作用。以小鼠外陰病變程度評分和小鼠陰道粘膜組織病理學(xué)檢查為指標評價皺瘤海鞘對生殖

5、器皰疹的治療作用。
　　 4.皺瘤海鞘體內(nèi)抗HSV-2作用機制研究運用小鼠陰道感染HSV-2的致病模型,研究了皺瘤海鞘對小鼠免疫細胞的的調(diào)節(jié)作用。在治療周期結(jié)束后,小鼠處死,取小鼠外周血抗凝,流式細胞術(shù)測定CD4,CD8陽性T細胞百分比,比較用藥后各組小鼠外周血T細胞亞群的差異,評價皺瘤海鞘對小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 運用小鼠陰道感染HSV-2的致病模型,研究了皺瘤海鞘對小鼠Th細胞因子的調(diào)節(jié)作用。在治療周期結(jié)束

6、后,小鼠處死,取小鼠外周血,收集血清,用酶聯(lián)免疫吸附分析法測定血清中IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10水平。比較用藥后各組小鼠外周血IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10的差異,評價皺瘤海鞘對小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 5.皺瘤海鞘抗HSV-2活性有藥效部位的篩選運用HSV-2在Vero細胞上的增殖模型,以CPE法和MTT比色法檢測細胞活性。以細胞存活率和半數(shù)細胞毒性濃度(CC50)為指標考察藥物的細胞毒性；以

7、病毒抑制率為指標,對皺瘤海鞘氯仿部位、正丁醇部位,水部位體外抗HSV-2的藥效活性作用進行評價；以病毒抑制率為指標考察了皺瘤海鞘水部位在體外對HSV-2病毒直接殺傷作用、對HSV-2吸附的阻斷作用以及對HSV-2病毒生物合成的抑制作用。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)處理本文所有計量資料數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析方法進行,先進行方差齊性檢驗,若方差齊,則應(yīng)用One-way ANOVA方法進行整體檢驗,用LSD方法進行組間多重比較,若方差不齊,則

8、應(yīng)用Welch方法進行整體檢驗,用DunnettT3方法進行組間多重比較。等級資料數(shù)據(jù)應(yīng)用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗進行分析。P<0.05,可認為組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。
　　 結(jié)果：
　　 1.藥物對Vero細胞毒性實驗結(jié)果顯示,與細胞對照組比較,皺瘤海鞘各組吸光度值均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),ACV組在1mg/ml濃度以下各組均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。皺瘤海鞘對Vero細胞的毒性

9、作用小,在10mg/ml濃度下細胞存活率仍有74.88％,其對Vero細胞的CC50值大于10mg/ml,陽性對照藥ACV的CC50為1.57mg/ml。
　　 2.藥物對HSV-2致細胞病變的抑制作用實驗結(jié)果顯示,皺瘤海鞘各組吸光度值與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),陽性對照藥阿昔洛韋(acylovir,ACV)0.01～0.04 mg/ml組吸光度與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。皺瘤海鞘對H

10、SV-2的半數(shù)有效濃度(EC50)為0.40mg/ml,TI>25,對HSV-2感染Vero細胞顯示出較強的保護作用；ACV50％病毒抑制率藥物濃度EC50=0.0067mg/ml,治療指數(shù)TI=224,對HSV-2顯示出較強的抑制作用。
　　 3.皺瘤海鞘對HSV-2直接殺傷活性應(yīng)用MTT法測定細胞活性,計算皺瘤海鞘對HSV-2病毒的抑制率。結(jié)果顯示,皺瘤海鞘在1 mg/ml時吸光度與病毒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01

11、),在2和1mg/ml時,其對病毒抑制率分別達74.19,64.52％,EC50為0.63mg/ml,TI值大于15.87。結(jié)果表明,皺瘤海鞘對病毒具有一定的直接殺傷活性。
　　 4.皺瘤海鞘對HSV-2增殖的影響運用MTT法測定細胞活性,計算皺瘤海鞘對HSV-2病毒的抑制率。實驗結(jié)果顯示,皺瘤海鞘2和1mg/ml組吸光度與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在2和1mg/ml時,其對病毒的抑制率分別達82.98％和

12、65.96％,在0.25mg/ml時,其對病毒抑制率也達29.79％。其EC50值為0.66mg/ml,TI值大于15.15,實驗結(jié)果提示,皺瘤海鞘對病毒復(fù)制具有一定的抑制作用。
　　 5.皺瘤海鞘對HSV-2吸附的阻斷作用運用MTT法測定細胞活性,計算皺瘤海鞘對HSV-2病毒的抑制率。實驗測得皺瘤海鞘各組吸光度值與病毒對照比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)計算求得,其在2mg/ml時,其對病毒抑制率達只有23.08％,沒有

13、超過50％。實驗結(jié)果提示皺瘤海鞘對病毒的吸附?jīng)]有阻斷作用。
　　 6.在病毒感染前后不同時間點加入皺瘤海鞘對HSV-2病毒的影響運用MTT法測定在不同時間點加入皺瘤海鞘對病毒復(fù)制的抑制作用,計算皺瘤海鞘對HSV-2病毒的抑制率。結(jié)果顯示,在病毒感染前2小時和感染后0,2,4,6小時加入藥物,最后測得的吸光度值與病毒對照比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；病毒在感染后0,2小時加入藥物對病毒抑制率達65％以上,對病毒顯示出明顯的

14、抑制作用。在感染后4,6小時加入藥物,對病毒抑制率分別是41.27％,34.92％,在感染后10小時加入藥物,對病毒復(fù)制沒有抑制作用。
　　 7.熒光定量PCR方法測定皺瘤海鞘對HSV-2病毒DNA復(fù)制的影響實驗結(jié)果顯示,與病毒對照組比較,皺瘤海鞘2,1,0.5 mg/ml組能使HSV-2DNA拷貝數(shù)下降2-3個數(shù)量級,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。實驗結(jié)果提示,皺瘤海鞘對HSV-2 DNA鏈復(fù)制有一定抑制作用。
　

15、　 8.RT-PCR法檢測皺瘤海鞘對HSV-2 DNA聚合酶UL30基因表達的影響RT-PCR擴增40個循環(huán)后,所有樣品均能擴增出特異性的β-actin片段,在皺瘤海鞘(2mg/ml)組和ACV組的均能檢測到DNA聚合酶UL30 mRNA的表達,但是與病毒對照組相比,表達量顯著降低,提示皺瘤海鞘對HSV-2DNA聚合酶的基因表達具有一定的干擾作用。
　　 9.皺瘤海鞘對小鼠生殖器皰疹的治療作用病毒攻擊后,經(jīng)過連續(xù)7天治療。實驗

16、結(jié)果顯示,海鞘可明顯減輕陰道感染HSV-2小鼠外陰腫脹,縮短病程。與模型組比較,陽性藥ACV組,海鞘高、低劑量組小鼠外陰病變評分都較小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。小鼠陰道組織病理學(xué)檢查,光鏡下,正常組的陰道粘膜完整,沒有炎細胞浸潤,沒有損傷表現(xiàn)。模型組小鼠陰道粘膜損傷嚴重,有大量的出血點,有大量炎細胞浸潤:ACV組,皺瘤海鞘高、低劑組陰道粘膜損傷較輕,只有少量炎細胞浸潤,沒有出血點。結(jié)果表明,皺瘤海鞘對小鼠生殖器皰疹具有一定治

17、療作用。
　　 10.皺瘤海鞘對感染HSV-2小鼠外周血T細胞亞群的影響病毒攻擊后,連續(xù)給藥治療7天。實驗結(jié)果顯示,與空白對照組相比較,模型對照組外周血中CD4+T細胞,CD8+T細胞百分比均具有顯著差異(P<0.01),可認為造模后兩者均顯著減少,免疫功能受到一定抑制。ACV治療組、海鞘治療組和模型對照組相比,小鼠外周血中CD4+T細胞,CD8+T細胞百分比均有顯著差異(P<0.01),可認為經(jīng)治療后,CD4+T細胞和CD8+

18、T細胞數(shù)量有了顯著提高。與空白對照組相比較,模型組外周血CD4+T細胞/CD8+細胞比值有顯著差異(P<0.01),可認為模型組CD4+T細胞和CD8+細胞平衡失調(diào)。ACV治療組、皺瘤海鞘治療組和模型對照組相比,外周血CD4+T細胞/CD8+細胞比值均具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05),可認為經(jīng)治療后,小鼠T細胞平衡失調(diào)得到明顯改善；與正常組比較,皺瘤海鞘治療組CD4+T細胞/CD8+細胞比值無顯著差異(P>0.05),ACV

19、治療組CD4+T細胞/CD8+細胞比值有顯著差異(P<0.01)。
　　 11.皺瘤海鞘對小鼠IL-2,IFN-γ細胞因子水平的影響病毒攻擊后,連續(xù)給藥治療7天。實驗結(jié)果顯示,與空白對照組相比較,模型對照組小鼠血清IL-2水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較,皺瘤海鞘高、低劑量組小鼠血清IL-2水平均有顯著增加(P<0.01),可認為皺瘤海鞘能提高小鼠IL-2的表達水平；與模型組比較,陽性藥(ACV)組小鼠血清IL-2水平

20、有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較,各組小鼠血清IFN-γ水平均無顯著性差異(P>0.05)。
　　 12.皺瘤海鞘對小鼠IL-4,IL-10細胞因子水平的影響病毒攻擊后,連續(xù)給藥治療7天。實驗結(jié)果顯示,與空白對照組相比較,模型對照組小鼠血清IL-4,IL-10水平無顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較,陽性藥(ACV)組小鼠血清IL-4,IL-10水平均無顯著性差異(P>0.05)；皺瘤海鞘高、低劑量

21、組與模型組比較,小鼠血清IL-4,IL-10水平均具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05),可認為皺瘤海鞘能夠提高致病小鼠IL-4,IL-10水平。
　　 13.皺瘤海鞘不同部位對Vero細胞毒性MTT法測定皺瘤海鞘不同部位對Vero細胞毒性。實驗測得皺瘤海鞘氯仿部位、正丁醇部位和水部位0.08～10mg/ml組吸光度值與細胞對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)；皺瘤海鞘氯仿部位對Vero細胞的CC50為

22、4.62mg/ml,皺瘤海鞘正丁醇部位對Vero細胞的CC50大于10mg/ml,皺瘤海鞘水部位對Vero細胞的CC50大于10mg/ml。
　　 14.皺瘤海鞘氯仿部位對HSV-2致細胞病變抑制效應(yīng)MTT法測定皺瘤海鞘氯仿對HSV-2致細胞病變抑制效果,結(jié)果顯示,各濃度組吸光度值與病毒對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),2mg/ml皺瘤海鞘氯仿部位對HSV-2抑制率為19.23％,沒有達到50％。實驗結(jié)果表明,皺瘤海鞘氯

23、仿部位對HSV-2無抑制作用。
　　 15.皺瘤海鞘正丁醇部位對HSV-2致細胞病變抑制效應(yīng)MTT法測定皺瘤海鞘正丁醇部位對HSV-2致細胞病變抑制效果,結(jié)果顯示,各濃度組吸光度值與病毒對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),2mg/ml皺瘤海鞘正丁醇部位HSV-2抑制率為11.54％。實驗結(jié)果表明,皺瘤海鞘正丁醇部位對HSV-2無抑制作用。
　　 16.皺瘤海鞘水部位對HSV-2致細胞病變抑制效應(yīng)MTT法測定皺瘤海鞘

24、水部位對HSV-2致細胞病變抑制效果。結(jié)果顯示,2、1及0.5mg/ml濃度組吸光度值與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,<0.05),2,1mg/ml瘤海鞘水部位對HSV-2病毒抑制率分別達到91.43％,77.14％,其EC50為0.67mg/ml,TI值大于14.93,結(jié)果表明,皺瘤海鞘水部位對HSV-2具有一定抑制作用。
　　 17.皺瘤海鞘水部位對HSV-2增殖的影響MTT法測定皺瘤海鞘水部位對HSV-2增

25、殖的影響。實驗結(jié)果顯示,皺瘤海鞘水部分各濃組吸光度值與病毒對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),皺瘤海鞘水部位2、1和0.5mg/ml時,其病毒抑制率分別達82.98,65.96和63.93％,EC50=0.49mg/ml,T>20.41。結(jié)果表明,皺瘤海鞘水部位對HSV-2增殖具有一定抑制作用。
　　 18.皺瘤海鞘水部位對HSV-2直接殺傷作用MTT法測定皺瘤海鞘水部位對HSV-2直接殺傷作用,結(jié)果顯示,皺瘤海鞘水部位各

26、濃度組吸光度值與病毒對照組比較均無計學(xué)意義(P>0.05),皺瘤海鞘水部位在2和1mg/ml時,其病毒抑制率分別達74.29％,60.00％,EC50=0.80mg/ml,T>12.50。結(jié)果表明,皺瘤海鞘水部位對病毒具有一定的殺傷活性。
　　 19.皺瘤海鞘水部位對HSV-2吸附的阻斷作用MTT法測定皺瘤海鞘水部位對HSV-2吸附的阻斷作用。實驗結(jié)果顯示,皺瘤海鞘水部位各組吸光度值與病毒對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

27、,在2mg/ml時,其病毒抑制率只有19.23％,沒有達到50％。實驗結(jié)果表明皺瘤海鞘水部位對HSV-2病毒吸附?jīng)]有阻斷作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.運用細胞模型證實皺瘤海鞘對HSV-2復(fù)制具有抑制作用。
　　 2.運用細胞模型證實皺瘤海鞘對HSV-2具直接殺傷作用,對HSV-2生物合成具有抑制作用,而對HSV-2吸附侵入細胞沒有阻斷作用。
　　 3.運用細胞模型證實皺瘤海鞘對HSV-2 DNA鏈復(fù)制延

28、長具有抑制作用,其作用靶點之一是抑制HSV-2DNA聚合酶基因表達。
　　 4.皺瘤海鞘能夠?qū)﹃幍栏腥綡SV-2小鼠生殖器皰疹具有治療作用。
　　 5.皺瘤海鞘能夠提高陰道感染HSV-2小鼠外周血液CD4+和CD8+T細胞亞群百分比,調(diào)節(jié)小鼠T細胞亞群的平衡；能提高陰道感染HSV-2小鼠血液Th細胞因子水平,從而調(diào)節(jié)和改善小鼠的免疫功能。這些可能是其對生殖器皰疹具有治療作用一個有效機制。
　　 6.皺瘤海鞘提取物