皺瘤海鞘抗單純皰疹病毒I型的實驗研究.pdf

1、目的:海鞘類動物(Ascidians)屬脊索動物門的尾索動物亞門,廣泛分布于世界各個海域中,自沿海水域至深海海底皆有其棲息,種類繁多,在自然界中已知有1500余種。海鞘在進化上所處的特殊地位,受到動物學(xué)者、進化論學(xué)者和內(nèi)分泌學(xué)者的高度關(guān)注,已成為科學(xué)工作者競相研究的熱點之一。20世紀(jì)80年代以來,人們已發(fā)現(xiàn)海鞘類生物中含有肽類、生物堿類、聚醚類、大環(huán)內(nèi)酯類、萜類等多種化合物,它們大部分具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物以及免疫調(diào)節(jié)、生物催化等

2、生理活性。
　　 我國南海有著豐富的海鞘資源,目前已發(fā)現(xiàn)有66種,皺瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]是其中的一種。皺瘤海鞘是一種可以食用的海鞘,國內(nèi)外有關(guān)其營養(yǎng)成分研究的報道很多,如氨基酸、多糖等。近年來,我們已經(jīng)對其進行了基礎(chǔ)的抗病毒實驗研究,實驗結(jié)果表示其在體內(nèi)外對乙肝病毒都有良好抑制作用,提示其具有一定的抗病毒活性。為了進一步研究皺瘤海鞘的抗病毒藥效,我們研究了皺瘤海鞘醇提取物對同是DNA病毒的單純

3、皰疹病毒Ⅰ型(herpes simlexvirus types-Ⅰ,HSV-Ⅰ)的抗病毒作用,并對其作用機理進行初步研究,為新型的抗HSV-Ⅰ藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 方法:本課題可分為以下三個部分:
　　 1.皺瘤海鞘醇提物體外抗HSV-Ⅰ型藥效學(xué)研究
　　 本研究以HSV-Ⅰ感染非洲綠猴腎細胞(vero細胞)為細胞模型,探討了皺瘤海鞘醇提物體外抗HSV-Ⅰ活性的藥效學(xué)作用。首先是應(yīng)用MTT法檢測皺瘤海鞘

4、醇提物對細胞的毒性作用,將對數(shù)生長期vero細胞消化計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h,形成單層細胞后棄培養(yǎng)液,加入對倍稀釋成6個濃度的皺瘤海鞘醇提物(10,5,2.5,1.25,0.63,0.32 mg/mL),每濃度4個復(fù)孔,同時設(shè)4個正常對照孔,每天使用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況,繼續(xù)培養(yǎng)3 d后,記錄細胞病變情況。每孔加入MTT溶液20μL,于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后,每孔加二甲基亞砜150μL,充分混勻后用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長

5、570nm處測定各組細胞的吸光度,以反映皺瘤海鞘醇提取物對vero細胞增殖活性的影響；然后以不同濃度的皺瘤海鞘醇提物與病毒混合后直接感染細胞,每一濃度設(shè)4個復(fù)孔,同時設(shè)陽性藥ACV對照組、正常細胞對照組及病毒對照組,置37℃,5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,每天使用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況,當(dāng)病毒對照病變達75％～100％時,記錄細胞病變情況,并使用用MTT法測定波長570nm處各組細胞的吸光度,按Reed-Muench法分別計算皺瘤海

6、鞘醇提物和ACV對vero細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)、皺瘤海鞘醇提物和ACV的半數(shù)抑制病毒有效劑量(IC50)和治療指數(shù)(TI)。
　　 2.皺瘤海鞘醇提取物體內(nèi)抗HSV-Ⅰ的實驗研究
　　 本實驗通過研究皺瘤海鞘醇提物對實驗動物單純皰疹病毒局部感染和全身感染的治療效果,探討了其在體內(nèi)抗HSV-Ⅰ藥效作用。局部感染模型為單純皰疹性角膜炎,選用健康豚鼠20只,按角膜劃痕方法,以1％戊巴比妥鈉生理鹽水腹腔注射7.5ml/

7、kg麻醉,用1ml注射器針頭井字劃痕(深度為角鞏緣微有滲血為度),滴加1滴HSV-Ⅰ病毒培養(yǎng)液,閉眼按摩15-30秒,2天后以1％熒光素鈉生理鹽水溶液染色,裂隙燈顯微鏡下觀察角膜病變(角膜上皮點狀、樹枝狀、地圖狀著色及基質(zhì)混濁)范圍。按病變的深淺、形態(tài)、嚴(yán)重程度搭配分為3組,每組6對(12只眼),分別給予生理鹽水、阿昔洛韋、皺瘤海鞘醇提物滴眼處理,3組均每天5次滴眼,每次1滴,連續(xù)15天,每隔3天用1％熒光素鈉生理鹽水溶液染色,裂隙燈顯

8、微鏡下觀察記錄病情變化,以角膜病變評分作為指標(biāo)；全身感染模型為腹腔注射病毒滴度為100 TCID50/0.1ml的病毒稀釋液0.4ml,分別給予皺瘤海鞘醇提物或阿昔洛韋進行治療,另設(shè)正常對照組和病毒對照組。持續(xù)給藥7天,以死亡率、體重、肝臟組織病理形態(tài)學(xué)為指標(biāo),評價了皺瘤海鞘醇提物對HSV-Ⅰ全身感染小鼠的治療作用。
　　 3.皺瘤海鞘醇提物抗HSV-Ⅰ作用機理的初步研究
　　 運用vero細胞體外藥效篩選模型,采用細胞

9、病變效應(yīng)CPE法和MTT兩種測定方法,三種不同的加藥方式在細胞水平上探討皺瘤海鞘乙醇提取物抗HSV-Ⅰ的作用機理。以不同劑量的皺瘤海鞘乙醇提取物作用于病毒復(fù)制周期的不同環(huán)節(jié),探索其在宿主細胞內(nèi)影響病毒復(fù)制過程的作用機理,揭示了皺瘤海鞘醇提物對HSV-Ⅰ的直接殺傷作用、對HSV-Ⅰ吸附的影響和對HSV-Ⅰ生物合成的抑制作用。
　　 結(jié)果:采用MTT法測得皺瘤海鞘醇提物對vero細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為6.868mg/ml,

10、而ACV對vero細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為0.254mg/ml,藥效學(xué)實驗選擇皺瘤海鞘醇提物的最大濃度為2mg/ml,阿昔洛韋的最大濃度為0.04mg/ml,所對應(yīng)的細胞存活率均大于80％；MTT法實驗結(jié)果表明皺瘤海鞘醇提物對HSV-Ⅰ所致的細胞病變有明顯的抑制作用,半數(shù)抑制病毒有效劑量(IC50)為0.230 mg/mL,治療指數(shù)(TI)為29.86。ACV的IC50為0.008 mg/mL,TI為31.75。兩者效果相當(dāng)。<

11、br>　　 從實驗結(jié)果可以看出,皺瘤海鞘醇提物滴眼第3天到15天,角膜病變迅速好轉(zhuǎn),非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis H法檢驗結(jié)果顯示第3天到15天治療組平均秩和低于病毒對照組,各治療組整體比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),進而分別進行給藥第三天、第六天、第九天、十二天、十五天時,皺瘤海鞘組與病毒對照組兩獨立樣本非參數(shù)檢驗,結(jié)果提示從第3天到9天皺瘤海鞘組的實驗動物與病毒對照組實驗動物角膜評分均有統(tǒng)計學(xué)意義差異(P值均小于0

12、.0167),皺瘤海鞘組動物愈合時間短,角膜病變程度輕。從實驗結(jié)果可見,給藥第12、15天各用藥組與對照組的平均秩和差距縮小,皺瘤海鞘組的實驗動物與不用藥組的病毒對照實驗動物角膜評分無統(tǒng)計學(xué)意義差異(P值均大于0.0167),這可能是對照組豚鼠部分角膜病變的自然愈合所致。初步的實驗結(jié)果表明,經(jīng)過皺瘤海鞘醇提物的治療,實驗動物角膜病變明顯減輕,皺瘤海鞘醇提物對單純皰疹病毒性角膜炎較為敏感,在體內(nèi)具有一定抗病毒活性,對實驗性單純皰疹性角膜炎

13、有明顯的療效。
　　 全身感染模型的實驗中,皺瘤海鞘組小鼠死亡率比病毒對照組低,與病毒對照組比較,皺瘤海鞘組的死亡率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。此外,皺瘤海鞘組小鼠的體重也有不同程度的增加,重復(fù)測量方差分析顯示,皺瘤海鞘醇提物治療的小鼠,給藥第六天的小鼠體重與病毒對照組相比,差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從病理切片結(jié)果顯示,與病毒對照組相比,皺瘤海鞘組小鼠其肝臟病理損害的減輕比較明顯,說明皺瘤海鞘能有效地減輕感染小鼠肝臟

14、的病理損害。
　　 實驗結(jié)果顯示不同濃度的皺瘤海鞘醇提物對HSV-Ⅰ病毒都有顯著的直接殺傷作用,濃度為2mg/ml時,累積存活率為96.44％,抑制HSV-Ⅰ所致細胞病變的效果隨濃度增加而增強,各濃度組的細胞吸光值與病毒對照組的吸光值比較,差異均具有顯著性(P<0.01)；高濃度的皺瘤海鞘醇提物對HSV-Ⅰ病毒的復(fù)制有一定的影響,低濃度對其影響不大,最高濃度2mg/mL時,細胞累積存活百分率為74.52％,各濃度組的吸光值與病毒

15、對照組的吸光值比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對HSV-Ⅰ病毒吸附的影響作用較弱,2 mg/ml時,其細胞累積存活率達只有40.01％,當(dāng)皺瘤海鞘濃度大于0.5mg/ml時,吸光值與病毒對照組的吸光值比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明了高濃度的皺瘤海鞘對病毒的吸附有一定的作用。
　　 結(jié)論:本實驗證實了皺瘤海鞘醇提物體外抗HSV-Ⅰ藥效作用理想,隨著濃度增加其藥效作用就越強,具有良好的量效關(guān)系。與陽性對

16、照物ACV相比,皺瘤海鞘醇提物對細胞毒性小,治療指數(shù)高,對HSV-Ⅰ病毒都有顯著的直接殺傷作用,高濃度的皺瘤海鞘醇提物對病毒的吸附、生物合成有一定的影響。在體內(nèi)實驗的局部模型和全身感染模型中,皺瘤海鞘均有一定的抗病毒作用,實驗觀察結(jié)果和特征都符合藥物藥效評價實驗要求,提示皺瘤海鞘醇提物可以進一步應(yīng)用于全面的抗單純皰疹病毒實驗研究的基礎(chǔ)工作。
　　 本次課題再次提示我們,皺瘤海鞘是天然產(chǎn)物,具有低毒、高效的特點,不同于常用合成類抗