非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中Nrf2信號(hào)通路抑制作用的研究.pdf

1、Nrf2-ARE信號(hào)通路在腫瘤化學(xué)預(yù)防和腫瘤耐藥性兩方面起著重要作用，Nrf2在細(xì)胞核中的累積可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性，而且現(xiàn)已成為增敏腫瘤細(xì)胞的有效藥靶。本研究主要分為3個(gè)部分。
　　 第一部分：通過構(gòu)建Keap1高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，探討Keap1對(duì)Nrf2信號(hào)通路的影響。我們將野生型mKeap1-pEGFP轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和H460，通過Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、PCR篩選得到Keap1穩(wěn)定表達(dá)的

2、細(xì)胞株A549-mKeap1-pEGFP（H1）和H460-mKeap1-pEGFP（N5），同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP建立對(duì)照組細(xì)胞株。與對(duì)照組相比，Keap1高表達(dá)的細(xì)胞株中Nrf2與其調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)均有降低。MTS法分析數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組細(xì)胞株相比，H1對(duì)抗癌藥物奧沙利鉑更敏感，在H460-N5細(xì)胞株中，抗癌藥物奧沙利鉑、阿霉素和依托泊苷的增敏作用明顯增強(qiáng)?？梢姡琄eap1過表達(dá)后，降低了Nrf2及其調(diào)控基因的表達(dá)，增敏非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

3、對(duì)抗腫瘤藥物的作用。
　　 第二部分：利用細(xì)胞核亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的一些特異性蛋白質(zhì)： Coilin、SMN、SC35、核孔復(fù)合體（nuclear pore complex，NPC）、RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）及Y12等標(biāo)記亞細(xì)胞器，研究Nrf2小分子抑制劑貝沙羅?。˙exarotene）對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄活性影響的機(jī)制，同時(shí)對(duì)Nrf2在細(xì)胞中的定位進(jìn)行了探討。激光共聚焦顯微鏡顯示，A549細(xì)胞中Nrf2與coilin、SMN之間存在共定

4、位，Bexarotene作用6h后，Coilin的表達(dá)增加，且Nrf2與eoilin的共定位增加，與錄抑制劑5-6-dichloro-1-B-D-ribofuranosylbenzimidazole（DRB）對(duì)細(xì)胞作用1h時(shí)的結(jié)果類似；SMN的表達(dá)也增加，且Nrf2與SMN的共定位增加，這一結(jié)果與鵝膏蕈堿（α-amanitin）對(duì)細(xì)胞作用lh時(shí)的結(jié)果相似，但是這一現(xiàn)象需要進(jìn)一步驗(yàn)證。由此可見Bexarotene可能通過coilin和SM

5、N等亞細(xì)胞器對(duì)Nrf2進(jìn)行調(diào)控。
　　 第三部分：為了進(jìn)一步研究Nrf2和coilin、SMN之間的相互作用關(guān)系，將eoilin轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其與Nrf2存在共定位現(xiàn)象；通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Nrf2與SMN存在相互作用。在其他一些細(xì)胞中都可以發(fā)現(xiàn)Nrf2與coilin、SMN的共定位。因此證明Nrf2與coilin、SMN之間存在共定位現(xiàn)象，并且具有普遍性。在結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞中，可見共定位現(xiàn)象，Bexarotene作用