miRNAs靶向調(diào)節(jié)人牙周膜細胞骨向分化中PLAP-1基因表達研究.pdf

1、研究背景:
　　 牙周組織(periodontaltissues，PDT)包括牙齦、牙周膜及礦化組織牙骨質(zhì)和牙槽骨。由于其組成多樣性及軟、硬結(jié)締組織、上皮之間相互作用使牙周組織發(fā)生改建與愈合比一般軟組織更復(fù)雜。正常牙周組織具有改建再生能力，如牙齒生理移動過程中有牙周膜改建，牙骨質(zhì)、牙槽骨新骨形成，特別是成骨現(xiàn)象，主要是生理反應(yīng)，不是病理損傷組織再生。當牙周病理損傷發(fā)生炎癥時波及牙周膜和牙槽骨，引起牙周附著喪失甚至導致牙齒缺失，其

2、再生能力非常有限，影響功能和美觀?，F(xiàn)代最有效牙周治療概念要求實現(xiàn)牙周組織再生(periodontaltissueregeneration，PDTR)，即有新的牙槽骨、牙骨質(zhì)及插入其中的膠原纖維產(chǎn)生。牙周再生修復(fù)是一個復(fù)雜的連續(xù)過程，其中礦化是牙周硬組織形成的重要階段，在這一生物礦化過程與鈣鹽的沉積、堿性磷酸酶活性有關(guān)，這是一個重要課題，其中調(diào)節(jié)牙周組織礦化相關(guān)細胞向有利于牙周組織再生方向發(fā)展的相關(guān)因素研究是未來研究的方向。
　　

3、 牙周膜細胞(periodontalligamentcells，PDLCs)是一個異質(zhì)性間充質(zhì)細胞群，組成具有多樣性特點，包括成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞以及這些細胞的前體細胞和具有多向分化潛能的干細胞，具有可分化為成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞等礦化細胞的能力，因此具有極高的骨向分化潛能。有趣的是，在體內(nèi)正常環(huán)境下，PDL為堅韌而富有彈性的結(jié)締組織且終生不被骨質(zhì)化，保持著一種自身穩(wěn)定(homeostasisofperiodontium)

4、的動態(tài)平衡。牙周膜細胞在維持這種自身穩(wěn)定的過程中起著極其重要的平衡作用，有研究顯示牙周膜細胞相關(guān)多種因素如基因、蛋白、細胞因子等參與組織再生和自身穩(wěn)定平衡過程的調(diào)節(jié)，而有關(guān)牙周膜細胞在組織再生與自身穩(wěn)定過程中的分子調(diào)節(jié)機制和分子調(diào)節(jié)信號通路等之間關(guān)系目前尚不清楚。
　　 牙周膜相關(guān)蛋白1(periodontalligamentassociatedprotein-1，PLAP-1)是新近發(fā)現(xiàn)的牙周組織專一性胞外基質(zhì)蛋白(Extra

5、cellularmatrix，ECM)，是一種牙周膜鈣化和礦化調(diào)節(jié)劑，在牙周膜新陳代謝，牙周組織改建、再生和維持牙周組織穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用的基因。2006年由Yamada等.首次發(fā)現(xiàn)并命名為PLAP-1，報道其極高表達于牙周組織，證實PLAP-1的表達水平隨牙周膜細胞礦化而升高。隨后，多家實驗室的數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)GF-2抑制PLAP-1的表達，而BMP-2上調(diào)PLAP-1的表達;PLAP-1在牙周膜中發(fā)揮了負性調(diào)節(jié)牙周膜細胞分化和礦化的作用

6、，阻止牙周組織發(fā)生非生理狀態(tài)下的骨化;以小鼠牙周膜細胞為模型，過表達PLAP-1使得堿性磷酸酶活性和形成礦化結(jié)節(jié)的能力受到抑制，通過調(diào)節(jié)BMP-2的活性抑制了牙周膜細胞的分化和礦化;PLAP-1阻礙BMP-2與其受體BMPR-IB的結(jié)合，抑制了BMP-2信號通路，從而抑制了礦化分化。PLAP-1在牙周韌帶中的表達受到礦化相關(guān)因子FGF，Smad，BMP-2，Runx2等影響，但具體的分子調(diào)節(jié)機理，尤其對PLAP-1基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)機

7、理目前尚不明了。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類進化上保守的非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，它本身不具有開放閱讀框(ORF)，通常的長度為20～24nt，但在3'端可以有1～2個堿基的長度變化，具有在翻譯水平調(diào)控基因表達的功能。尤其miRNAs是參與靶基因功能作用調(diào)節(jié)的重要因子，具有組織特異性和時序性，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或降解蛋白翻譯，成為近幾年的研究熱點。有關(guān)牙周膜細胞

8、骨向分化調(diào)節(jié)組織特異性基因的miRNAs研究很少，參與調(diào)節(jié)牙周膜細胞成骨分化特異性基因的miRNAs差異表達及功能調(diào)節(jié)作用的研究國內(nèi)外尚未見報道。特別是有關(guān)miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平對牙周膜相關(guān)特異性基因PLAP-1的表達調(diào)節(jié)及特異性基因PLAP-1的miRNAs調(diào)節(jié)對牙周膜細胞增殖和成骨分化功能作用的影響研究，目前國內(nèi)外均尚未見報道。miRNAs是否在牙周膜細胞骨向分化中發(fā)揮著不可或缺的作用？對牙周膜細胞特異性基因的功能調(diào)控如何？對于這

9、些問題的探索和回答都是嶄新的前沿研究領(lǐng)域。因此，本論文旨在研究參與靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因表達的miRNAs以及其對靶基因PLAP-1的調(diào)節(jié)作用在人牙周膜細胞增殖和牙周膜細胞骨向分化中功能調(diào)節(jié)作用的影響。
　　 本論文主要包括以下四章內(nèi)容:
　　 第一章:PLAP-1基因在人牙周膜細胞及其骨向分化中的表達
　　 目的:建立體外培養(yǎng)人牙周膜細胞及其骨化誘導研究模型，觀察和驗證體外培養(yǎng)人牙周膜細胞及其骨向分化誘導中P

10、LAP-1基因表達。
　　 方法:本研究采用體外酶消化法培養(yǎng)人牙周膜細胞并進行間充質(zhì)來源細胞表面標記檢測，用MTT法、茜素紅及VonKossa染色、免疫組化、ALP、RT-PCR和Westernblot等方法進行檢測牙周膜細胞增殖及PLAP-1基因在人牙周膜細胞及其骨向分化誘導中的表達模式。
　　 結(jié)果:本實驗成功培養(yǎng)人牙周膜細胞模型并成功進行牙周膜細胞骨向分化誘導，細胞增殖和礦化狀態(tài)良好，檢測PLAP-1基因在人牙周膜

11、細胞中大量分布，主要分布在細胞核周圍的細胞漿中，胞漿末端很少，PLAP-1基因在牙周膜細胞中及其骨向分化誘導進行中持續(xù)表達并隨礦化時間的進行呈逐漸增加趨勢。
　　 結(jié)論:研究結(jié)果表明本實驗培養(yǎng)的牙周膜細胞模型保持了間充質(zhì)來源細胞群牙周膜細胞原有的特性，細胞增殖狀態(tài)良好，經(jīng)礦化誘導能夠向成骨方向分化并在分化中表現(xiàn)牙周膜特異性基因PLAP-1的正常表達，為進一步研究PLAP-1基因在人牙周膜細胞及其骨向分化誘導中的表達變化和分子調(diào)節(jié)

12、機制提供細胞模型實驗基礎(chǔ)。
　　 第二章:miRNAs靶向調(diào)控PLAP-1基因表達的篩選和驗證
　　 目的:篩選和驗證靶向調(diào)控牙周膜特異性基因PLAP-1表達的miRNAs，驗證檢測在人牙周膜細胞骨向分化中PLAP-1基因和靶向調(diào)控PLAP-1基因表達的miRNAs的表達趨勢及PLAP-1與靶miRNAs在牙周膜細胞成骨分化中表達趨勢的關(guān)聯(lián)性。
　　 方法:首先利用Targetscan、miRBase、micro

13、RNA.org和miRGen-miRanda等生物學軟件和數(shù)據(jù)庫對潛在靶向PLAP-1基因的miRNAs進行預(yù)測分析，然后取四個軟件共同交集靶位點的miRNAs作為研究對象，結(jié)果得到307種miRNAs具有潛在靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的能力，其中有5種為共同交集預(yù)測miRNAs極具潛在靶向能力的重要信息作為深入研究對象。為進一步篩選驗證在牙周膜細胞中能夠靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因miRNAs，采用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)和定量RT-PC

14、R方法對靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的miRNAs進行篩選驗證并采用定量RT-PCR方法檢測PLAP-1基因和靶miRNAs在人牙周膜細胞骨向分化中表達變化趨勢，采用定量RT-PCR和Westernblot等方法驗證PLAP-1基因和蛋白和靶miRNAs表達趨勢與人牙周膜細胞成骨分化中表達量變化趨勢的關(guān)聯(lián)性。
　　 結(jié)果:Targetscan、miRBase、microRNA.org和miRGen-miRanda四個軟件交集靶位點的

15、miRNAs作為研究對象，結(jié)果顯示miR144、miR26a、miR26b、miR21和miR101共5種miRNAs為極具潛在靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因能力miRNAs。雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析結(jié)果顯示加入PLAP-1基因后各組的熒光素酶活性具有顯著差異(F=11.050，P＜0.001)，采用LSD的多重比較方法表明，psiPLAP-1+miR21的熒光素酶活性分別與psiPLAP+Blank、psiPLAP+miR26a、psiPLA

16、P+miR26b、psiPLAP+miR144比較均有下降，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，psiPLAP-1+miR101的熒光素酶活性分別與psiPLAP+Blank、psiPLAP+miR26a、psiPLAP+miR26b、psiPLAP+miR144比較均有下降，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但是psiPLAP-1+miR26a、psiPLAP-1+miR26b及psiPLAP-1+miR144分別與psiPLA

17、P-1+Blank組進行兩兩比較均無顯著差異(P＞0.05)，說明miR21和miR101能夠靶向結(jié)合PLAP-13'UTR從而抑制熒光素酶的活性，可進行后續(xù)深入研究。PLAP-1基因在人牙周膜細胞骨向分化過程中隨礦化時間增加，其定量RT-PCR的表達量不斷增長變化差異具有統(tǒng)計學意義(F=291.982，P＜0.001)。而靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的miR21或miR101在人牙周膜細胞骨向分化過程中隨礦化時間增加其定量RT-PCR的表

18、達量不斷減少且不同時間點之間的表達量變化差異具有統(tǒng)計學意義，有顯著差異(F=181.266，P＜0.001;F=40.233，P＜0.001)。在牙周膜細胞中瞬轉(zhuǎn)過表達miR21或miR101時PLAP-1基因表達變化差異明顯(F=120.691，P=0.001)，其中加入miR21或miR101后，PLAP-1基因的表達量相比起正常細胞顯著減少(P=0.012，P=0.002)，變化趨勢相反。
　　 結(jié)論:miR21和miR1

19、01能夠結(jié)合PLAP-13'UTR靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因表達，而miR26a，miR26b和miR144則不能。miR21及miR101表達量變化和靶基因PLAP-1在人牙周膜細胞骨向分化過程中表達量變化分別呈負相關(guān)變化趨勢。過表達miR21或miR101均可抑制靶基因PLAP-1表達。因此從5個候選miRNAs中篩選和鑒定出靶向PLAP-1基因的miRNAs（miR21、miR101）做后續(xù)進一步深入研究和分析。
　　 第三

20、章:miR21/miR101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的結(jié)合位點分析
　　 目的:分析miR21/miR101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的結(jié)合位點。
　　 方法:采用MicroRNA.org軟件結(jié)分析及預(yù)測miR21或miR101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的結(jié)合位點。用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)和定量RT-PCR方法分析miR21或miR101與靶基因PLAP-1的結(jié)合位點，然后對結(jié)合位點進行定點突變并進行驗證結(jié)合位點分析。<

21、br>　　 結(jié)果:用MicroRNA.org軟件分析預(yù)測獲得miR21或miR101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的結(jié)合位點后，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染克隆有psiPLAP-13'UTR質(zhì)粒的多組間的熒光素酶活性差異進行比較具有顯著差異(F=881.425,P＜0.001)，其中psiPLAP-13'UTR+Blank與psiPLAP-13'UTR+NC之間沒有顯著差異(P＞0.05)，但psiPLAP-13'UTR+

22、miR21、psiPLAP-13'UTR+miR101分別與psiPLAP-13'UTR+NC比較熒光素酶活性均有下降，且具有顯著差異(P=0.008和P＜0.001),psiPLAP-13'UTR+miR21與psiPLAP-13'UTR+miR101相比也有顯著差異(P＜0.05)，這表明psiPLAP-13'UTR質(zhì)粒與miR21或miR101結(jié)合能夠抑制雙熒光素酶活性。另外，在轉(zhuǎn)染克隆有結(jié)合位點定點突變mutpsiPLAP-13

23、'UTR質(zhì)粒+miR21或miR101的實驗組中，其熒光素酶活性與psiPLAP-13'UTR+Blank、psiPLAP-13'UTR+NC組比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，結(jié)果表明結(jié)合位點定點突變后mutpsiPLAP-13'UTR質(zhì)粒不能與miR21或miR101結(jié)合，即PLAP-13'UTR與miR21和miR101的結(jié)合位點突變完全，從而不能影響雙熒光素酶活性的變化。
　　 結(jié)論:經(jīng)分析和驗證確定miR21和miR

24、101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的結(jié)合位點為miR101與靶基因PLAP-13'UTR結(jié)合位點為338-345位點7個堿基（gtactgt）、miR21與靶基因PLAP-13'UTR結(jié)合位點為748-755位點7個堿基(ataagct)。根據(jù)本章所得結(jié)果選擇抑制熒光素酶活性較強、調(diào)節(jié)PLAP-1基因表達量變化較顯著的has-mir-101作為進一步研究對象，探討其與PLAP-1靶基因之間的功能調(diào)節(jié)作用，并深入研究miR101對PLAP-1

25、靶基因的調(diào)節(jié)對人牙周膜細胞增殖和骨向分化等功能作用的調(diào)節(jié)影響。
　　 第四章:miR101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因的功能研究
　　 目的:研究miR101靶向調(diào)節(jié)PLAP-1基因?qū)ρ乐苣ぜ毎晒欠只屑毎鲋澈凸腔δ艿挠绊憽?br>　　 方法:首先獲得miR101過表達和表達抑制的慢病毒，進行預(yù)實驗測定慢病毒穩(wěn)定感染牙周膜細胞的MOI值，依此對牙周膜細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR101過表達和表達抑制慢病毒，研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi

26、R101過表達和表達抑制慢病毒載體后人牙周膜細胞增殖和骨向分化誘導過程中miR101對PLAP-1基因靶向調(diào)節(jié)對人牙周膜細胞增殖和骨向分化功能的影響。采用MTT法檢測細胞增殖周期，誘導牙周膜細胞骨向分化過程中用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成能力并用酶活性檢測法檢測ALP活性變化，采用定量RT-PCR和Westernblot方法檢測人牙周膜細胞骨向分化過程中靶基因PLAP-1基因和蛋白表達量變化并進行比較。
　　 結(jié)果:MTT法檢測牙

27、周膜細胞增殖數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，時間和分組的主效應(yīng)、時間和分組的交互效應(yīng)均具有統(tǒng)計學差異(F=1340.419，P＜0.001;F=703.856，P＜0.001;F=201.765，P＜0.001)?？蛰d組和miR101組在四個時間點具有相似的增長趨勢，但是anti-miR101組的增長趨勢較前兩者緩慢。在剔除了時間因素的影響下，mir101組和空載組中MTT的OD值較anti-miR101組上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.00

28、1)。在剔除了分組因素的影響下，四個時間點下MTT的OD值均呈上升的趨勢，且兩兩比較差異都具有統(tǒng)計學意義（P值均小于0.001）。在固定第七天時，三組之間的兩兩比較均有顯著差異(P值均小于0.001)。結(jié)果表明過表達miR101增強牙周膜細胞骨化過程中的細胞增殖，抑制表達anti-miR101抑制牙周膜細胞骨化過程中的細胞增殖。
　　 ALP活性測定數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示時間和分組的主效應(yīng)(F=190.901，P＜0.001;F=13

29、7.811，P＜0.001)、時間和分組的交互效應(yīng)均具有統(tǒng)計學差異(F=47.362,P＜0.001)，其中以anti-miR101組在第0天時的ALP活性最低，而miR101組在第21天時ALP活性最高。在剔除了時間因素的影響下，三組中每兩組的ALP活性值具有顯著差異，其中空載組和anti-miR101組中細胞ALP活性較miR101組均有下調(diào)（P值均小于0.001）。在剔除了分組因素的影響下，四個時間點中每兩個時間點的ALP活性值均

30、有顯著差異(P值均小于0.001），ALP活性值隨著時間逐漸上調(diào)。結(jié)果表明過表達miR101增強牙周膜細胞骨化過程中的鈣鹽沉積，抑制表達anti-miR101抑制牙周膜細胞骨化過程中的鈣鹽沉積。
　　 PLAP-1基因表達的定量RT-PCR測定數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示，時間和分組分別作為主效應(yīng)均具有顯著差異(F=6.400，=0.008;F=48.994，P＜0.001)，時間和分組之間具有交互作用，也具有統(tǒng)計學差異(F=6.180，P

31、=0.003)。其中miR101在第21天時定量PCR的表達量最低?？蛰d組隨著時間的變化，定量RT-PCR的值逐漸上調(diào)，而miR101組恰好相反，anti-miR101組定量RT-PCR檢測表達量在第7和第14天與miR101基本一致，但在第21天時比miR101組上調(diào)。在剔除了時間因素的影響下，miR101組和anti-miR101組中定量RT-PCR檢測表達量較空載組均有下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.001)。在剔除了分組

32、因素的影響下，第14天、第21天三組的表達量較第7天均上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.025和P=0.003)?？蛰d組與miR101在第7天、第14天和第21天的定量PCR值均有顯著差異(P值均小于0.001)，結(jié)果說明miR101過表達抑制了PLAP-1基因表達量，而anti-miR101抑制表達后增加了靶基因PLAP-1表達量。
　　 礦化結(jié)節(jié)形成染色觀察和Westernblot法蛋白檢測結(jié)果顯示，與空載組比較mi

33、R101過表達組礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量和PLAP-1蛋白表達均呈增加變化趨勢;而與空載組比較anti-miR101抑制表達組礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量和PLAP-1蛋白表達均呈減少變化趨勢。
　　 結(jié)論:研究結(jié)果顯示miR101過表達后抑制了靶基因PLAP-1表達，減弱了PLAP-1基因?qū)ρ乐苣ぜ毎窍蚍只呢撜{(diào)節(jié)作用，增強了牙周膜細胞的增殖和礦化能力，而anti-miR101表達抑制后增加了PLAP-1基因表達，增強PLAP-1基因?qū)ρ乐苣ぜ?/p>