糖基化終末產(chǎn)物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞骨向分化能力的影響以及miR-17的調(diào)控作用.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)AGEs對(duì)人牙周膜干細(xì)胞骨向分化的影響，以及mir-17在AGEs介導(dǎo)的人牙周膜干細(xì)胞骨向分化過(guò)程中表達(dá)的改變。
　　 方法：有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化HPDLSCs；流式細(xì)胞儀鑒定HPDLSCs的表型分子；MTT檢測(cè)對(duì)照組(正常培養(yǎng)液培養(yǎng))和實(shí)驗(yàn)組(含AGEs濃度分別為1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml，200ug/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng))PDLSCs的增殖情況；成骨誘導(dǎo)7天后分別對(duì)對(duì)照組(正常成骨誘導(dǎo)

2、液誘導(dǎo))和實(shí)驗(yàn)組(含AGEs濃度為1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml，200ug/ml的成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo))PDLSCs進(jìn)行ALP染色，21天后茜素紅染色，十六烷基吡啶進(jìn)行定量分析；RT-PCR和western blot分別檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PDLSCs成骨基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)；采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)和抑制miR-17在AGE-PDLSCs中的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)AGE-PDLSCs的骨向分化的影響。
　　 結(jié)果：

3、1.HPDLSCs的分離及純化：本實(shí)驗(yàn)用組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，7天左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，2-3周左右匯集達(dá)到80％，克隆細(xì)胞大多呈長(zhǎng)梭形，胞漿豐滿，胞體較小。2.細(xì)胞表面分子鑒定：CD105、CD146、STRO-1、CD44表達(dá)均呈陽(yáng)性，CD105的陽(yáng)性率為80.8％、CD146的陽(yáng)性率為24.8％、stro-1的陽(yáng)性率為7.9％、CD44的陽(yáng)性率為99.8％，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明分離的細(xì)胞具有干細(xì)胞特點(diǎn)。3.MTT顯示：不同濃度的AGEs對(duì)

4、PDLSCs增殖能力的影響有所差別，高濃度(100ug/ml，200ug/ml)明顯抑制PDLSCs的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，低濃度(1ug/ml，10ug/ml)對(duì)PDLSCs的增殖能力影響不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。4.鈣化結(jié)節(jié)的形成：成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)兩組PDLSCs，第21天時(shí)，茜素紅染色，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組鏡下均可見(jiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)，十六烷基吡啶定量顯示1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、200ug

5、/ml實(shí)驗(yàn)組礦化能力均比對(duì)照組低，其中200ug/ml AGEs礦化能力最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。不同濃度的實(shí)驗(yàn)組之間礦化能力也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，結(jié)果顯示隨著AGEs濃度的升高，牙周膜干細(xì)胞的礦化能力逐漸降低。5.ALP染色：細(xì)胞分組同茜素紅染色，對(duì)照組加入不含AGEs的成骨誘導(dǎo)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含AGEs終濃度為1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)一周，染色后觀

6、察：對(duì)照組細(xì)胞顏色最深，1ug/mlAGEs濃度刺激的牙周膜干細(xì)胞顏色次之，且隨著AGEs濃度增高，染色的顏色逐漸變淺，各濃度之間觀察有差異。6.Real time PCR結(jié)果：1)成骨基因的表達(dá)：成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞RUNX-2、ALP、COL1的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。2)mir-17的表達(dá)：與0天對(duì)照相比，成骨誘導(dǎo)后1天3天7天14天21天對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組mir-17的表

7、達(dá)均下調(diào)，但實(shí)驗(yàn)組mir-17的表達(dá)下調(diào)較正常組高。其中第7天下調(diào)最為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。7.western blot結(jié)果：成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(AGEs濃度為10ug/ml)細(xì)胞7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Runx2、osterix的蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組。8.轉(zhuǎn)染結(jié)果：1)轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)：RT-PCR檢測(cè)mir-17的轉(zhuǎn)染效率，mir-17分別上調(diào)了60倍，抑制了接近20倍。2)上調(diào)mir-17后成骨基因的檢測(cè)：

8、RT-PCR檢測(cè)上調(diào)mir-17后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組成骨基因表達(dá)水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組BSP、RUNX-2、ALP的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；western blot顯示實(shí)驗(yàn)組RUNX-2的蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組。3)下調(diào)mir-17后成骨基因的檢測(cè)：RT-PCR檢測(cè)下調(diào)mir-17后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組成骨基因表達(dá)水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組BSP、RUNX-2、ALP的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(