超聲微泡介導(dǎo)人骨形成蛋白-2基因在人牙周膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、近年來以生長因子局部應(yīng)用為代表的牙周再生治療受到廣泛關(guān)注和研究。骨誘導(dǎo)形成蛋白.2（BMP2）是唯一能夠單獨誘導(dǎo)成骨的生長因子，在牙周組織中的分子調(diào)節(jié)作用也已經(jīng)比較明確。它可誘導(dǎo)牙周組織中未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，對人牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDLFs）具有成骨定向分化誘導(dǎo)作用，但局部直接使用時存在著易流失、效率低等問題?；蛑委熂夹g(shù)的應(yīng)用可以使外源性的BMP2直接在宿主細(xì)胞內(nèi)完成表達(dá)和后加工，減少全身的毒副作用，增強了

2、局部治療效果，為牙周組織再生提供了廣闊的研究前景。導(dǎo)入方法的選擇是決定基因治療效果的關(guān)鍵因素。超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種新型的、安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法，目前已應(yīng)用于心臟、血管、肝臟、腎臟、骨骼肌、眼等領(lǐng)域的基因轉(zhuǎn)染實驗研究中，已有大量研究表明，超聲介導(dǎo)微泡造影劑破裂可增強目的基因在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染與表達(dá)。但該技術(shù)用于人牙周組織的報道較少，本課題以hBMP2為目的基因?qū)⒊曃⑴蒉D(zhuǎn)基因技術(shù)用于轉(zhuǎn)染HPDLFs，并觀察轉(zhuǎn)染后目的基因在HPDLFs

3、中的表達(dá)情況，為該技術(shù)在牙周再生基因治療方面的進(jìn)一步研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 構(gòu)建帶有目的基因hBMP2的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BMP2，然后利用超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)入HPDLFs，并檢測轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)情況。
　　 方法：
　　 1.采用組織塊法原代培養(yǎng)HPDLFs，通過形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取3～5代細(xì)胞用于實驗。
　　 2.根據(jù)Genbank

4、數(shù)據(jù)庫中hBMP2的cDNA序列（Gen-Bank，Accession No.NMOO1200），利用Primer Premier5設(shè)計軟件設(shè)計并合成引物，從人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系中提取總RNA，采用RT-PCR方法獲得hBMP2基因，連接pMDl9-T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并篩選陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定及測序正確后，用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pMD19-T-BMP2與pEGFP-N1質(zhì)粒，再將回收、純化后的BMP2基

5、因和pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，篩選pEGFP-N1-BMP2的陽性克隆，鑒定正確后用于后續(xù)實驗。
　　 3.利用超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在聲強為0.5 w/cm2，間斷波輻照時間60 s，微泡濃度為15％的條件下將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)入HPDLFs中，同時以在相同條件下轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1組及未轉(zhuǎn)染組做對照，通過熒光顯微鏡，RT-PCR和免疫熒光技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后HPDLFs中BMP2的表達(dá)情況。

6、r>　　 結(jié)果：
　　 1.牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)成功并傳代。
　　 2.成功克隆人BMP2基因，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BMP2。
　　 3.超聲微泡轉(zhuǎn)基因技術(shù)在適當(dāng)?shù)臈l件下可將攜帶目的基因BMP2的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP2成功轉(zhuǎn)入HPDLFs；經(jīng)RT-PCR及免疫熒光檢測顯示，與對照組相比pEGFP-N1-BMP2轉(zhuǎn)染組中BMP2在HPDLFs內(nèi)的瞬時表達(dá)明顯增強。
　　 結(jié)