內(nèi)源性硫化氫調(diào)控Wnt-β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞骨向分化.pdf

1、目的:
　　牙周炎作為人類口腔最常見的三大疾病之一，可導(dǎo)致牙周軟硬組織，特別是牙槽骨的吸收，使得牙周炎患牙松動(dòng)、脫落，是成人失牙最主要的原因。牙周膜中的牙周膜細(xì)胞(Periodontal Ligament Cells，PDLCs)具有多向分化的潛能，能分化成成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，在牙周組織修復(fù)再生中發(fā)揮重要作用。然而PDLCs骨向分化的調(diào)控機(jī)制極為復(fù)雜，存在多條信號(hào)途徑，如一氧化氮(Nitric oxide，NO)

2、、前列腺素（Prostaglandins）、鈣離子通道等。
　　內(nèi)源性硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S），是近期發(fā)現(xiàn)的繼一氧化碳(Carbonmonoxide，CO)、一氧化氮之后的第三大氣體信號(hào)分子，能在細(xì)胞內(nèi)合成，通過自由擴(kuò)散至細(xì)胞外參與調(diào)節(jié)眾多人體生理功能，如大腦發(fā)育、血壓調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等。體內(nèi)H2S合成異常，可導(dǎo)致多種系統(tǒng)性疾病，如晶狀體脫落、早發(fā)性動(dòng)脈硬化、血栓和骨質(zhì)疏松等。體外研究表明，低濃度的內(nèi)源性H

3、2S能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化。體內(nèi)研究也證實(shí)，內(nèi)源性H2S可通過調(diào)節(jié)鈣離子通道，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而參與調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone MarrowMesenchymal Stem Cells，BMMSCs)的自我更新和成骨分化。其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控途徑，在骨代謝中發(fā)揮著重要作用。但是目前尚無證據(jù)表明PDLCs是否也能合成內(nèi)源性H2S，從而通過調(diào)控Wnt/β-c

4、atenin信號(hào)通路參與PDLCs骨向分化的調(diào)控。因此，本研究旨在探討內(nèi)源性H2S在原代PDLCs中的合成機(jī)制及對(duì)與成骨分化的調(diào)控作用，為牙周組織再生指導(dǎo)臨床牙周炎治療提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　收集因阻生拔除的第三磨牙，酶消化結(jié)合組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞(Human Periodontal Ligament Cells，hPDLCs)。取3-5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好、性狀穩(wěn)定的hPDLCs用于實(shí)驗(yàn)。采用MTT法檢測(cè)

5、H2S對(duì)hPDLCs增殖的影響。hPDLCs與不同濃度的H2S體外供體硫氫化鈉(NaHS)以及H2S合成酶胱硫醚β-合成酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase，CSE）抑制劑D，L-炔丙基甘氨酸(D，L-propargylglycine，PAG)、羥胺（Hydroxylamine，HA)共孵育。免疫熒光檢測(cè)hPDLCsCBS、CSE的表達(dá)，測(cè)定hPDLCs

6、培養(yǎng)上清液中H2S表達(dá)水平，PCR和Western blotting檢測(cè)成骨關(guān)鍵蛋白骨鈣素(Osteocalcin，OCN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related Transcription Factor2，RUNX2)、Ⅰ型膠原(Collagen TypeⅠ，COL-Ⅰ)基因和蛋白水平的表達(dá);堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)、茜素紅染色檢測(cè)早期和晚期階段骨向分化能力。結(jié)合Wnt/β-caten

7、in信號(hào)通路激動(dòng)劑Wnt3a探討該通路在其中的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1、原代培養(yǎng)細(xì)胞抗角蛋白染色陰性，抗波形蛋白染色陽性，提示為中胚層來源，即為hPDLCs。免疫熒光染色顯示hPDLCs表達(dá)兩種H2S合成酶CBS、CSE，并通過其合成H2S。10μmol/L、100μmol/L NaHS能略促進(jìn)hPDLCs的增殖，而1000μmol/L NaHS在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖。與不同濃度NaHS孵育不同時(shí)間后，hPD

8、LCs未出現(xiàn)形態(tài)改變。成骨能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低或高濃度的H2S均抑制hPDLCs成骨蛋白的表達(dá)以及下調(diào)堿性磷酸酶的表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成。上調(diào)低濃度的H2S后可部分恢復(fù)hPDLCs成骨分化功能。
　　2、低或高濃度的H2S均抑制成骨蛋白及Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin、LEF1、CyclinD等的表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑Wnt3a能上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，

9、H2S合成酶抑制劑PAG則下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵指標(biāo)的表達(dá)。成骨蛋白COL-Ⅰ和RUNX2、ALP表達(dá)和活性、礦化能力等成骨指標(biāo)均有所上升。
　　結(jié)論:
　　1、人牙周膜細(xì)胞通過H2S合成酶CBS、CSE合成H2S。過高或過低濃度的H2S都將抑制細(xì)胞骨向分化。上調(diào)低濃度H2S后可部分恢復(fù)成骨分化功能。
　　2、人牙周膜細(xì)胞內(nèi)源性合成的H2S處于合適濃度時(shí)，可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從