濃縮生長因子對人牙周膜干細胞增殖及成骨分化能力的影響.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在將體外原代培養(yǎng)的人牙周膜干細胞(human periodontal ligamentstem cells，hPDLSCs)接種于濃縮生長因子（concentrated growth factors，CGF）纖維蛋白膜上，以臨床較普遍應用的海奧生物膜作為對照，觀察hPDLSCs在兩種膜表面增殖以及成骨分化的情況，從而為骨組織工程構建一種新型移植物提供理論依據。
　　研究方法:
　　1.hPDLS

2、Cs體外分離培養(yǎng)與鑒定
　　通過酶消化法對hPDLSCs進行原代培養(yǎng)，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化細胞;利用流式細胞儀檢測細胞表面間充質干細胞抗原標志物的表達;在體外成骨、成脂肪、成軟骨條件下對hPDLSCs進行誘導，檢測其多向分化潛能;進行hPDLSCs的傳代，收集第3代細胞用于后續(xù)實驗。
　　2.CGF制備與結構特點分析:
　　利用特殊Vacuette真空采血管抽取患者靜脈血9ml，置入配套Medifuge離心機差速離

3、心。棄除上部血清層與底部紅細胞層，將中間CGF纖維蛋白層凝膠壓制成膜，HE法檢測其組織結構，ELISA法分析內部生長因子釋放特點。
　　3.實驗分組與細胞接種
　　(1)實驗分組:CGF膜組、海奧膜組及空白組。
　　(2)接種培養(yǎng):取生長狀態(tài)良好的第3代hPDLSCs，消化離心后成特定密度的單細胞懸液，分別接種于CGF膜表面、海奧膜疏松層表面、空白24孔板中。
　　4.貼壁檢測:接種5天后，于光學顯微鏡下觀察、拍

4、照。
　　5.細胞接種培養(yǎng)1、3、5、7天后，應用CCK-8法繪制細胞生長曲線，檢測三組不同條件對hPDLSCs增殖活性的影響。
　　6.成骨誘導7天后應用實時定量PCR及Western-Blot法對hPDLSCs進行成骨相關mRNA及成骨相關蛋白表達量的檢測，研究其成骨能力的變化。
　　研究結果:
　　1.本實驗成功應用酶消化法在體外分離培養(yǎng)hPDLSCs，所篩選細胞在形態(tài)上符合成纖維樣細胞特點;誘導條件下可向

5、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞方向分化，符合干細胞的特征;流式細胞儀檢測結果顯示人間充質干細胞表面陽性標記物(CD73，CD90，CD105，CD44)在hPDLSCs表面呈現高表達，陰性標記物(CD11b，CD19，CD34，CD45，HLA-DR)在hPDLSCs表面無表達。
　　2.靜脈血經差速離心后分三層，中間凝膠狀物質即為CGF，壓制成膜后，HE染色見其主要由纖維蛋白網格構成，內嵌合大量白細胞與血小板，底部有薄層紅細胞;E

6、LISA檢測結果顯示其主要生長因子TGFβ-1、PDGF-BB與IGF-1雖釋放規(guī)律不同，但均可長效釋放。
　　3.貼壁檢測結果顯示:光學顯微鏡下可見hPDLSCs由CGF膜表面順延爬出，細胞長軸與CGF表面基本垂直，以膜為中心呈現放射性生長，膜周邊細胞呈梭形，排列緊密，垂直附著于CGF膜表面，使其呈固定狀態(tài)，不隨培養(yǎng)基漂移;海奧膜膜外細胞生長相對無序，細胞呈梭形，排列稀疏，板底細胞與海奧膜間未發(fā)生附著關系。
　　4.CCK

7、-8結果顯示:同海奧膜組與空白組相比，膜培養(yǎng)1、3、5及7天后CGF膜組細胞數量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義;但第1-3天，海奧膜組與空白組細胞增殖活性無明顯統(tǒng)計學意義，第3-5天海奧膜組細胞數量高于空白組(P＜0.05)，第5-7天時空白組細胞數量高于海奧膜組(P＜0.05)。
　　5.RT-PCR結果顯示:三組細胞均在成骨條件下誘導7天后，CGF膜組的成骨相關基因ALP、Col-Ⅰ、OPN、Runx-2的mRNA表達均高于其它

8、兩組(P＜0.05)，海奧膜組次之，空白組即基礎成骨誘導液組最低，各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.Western-Blot結果顯示:三組細胞均在成骨條件下誘導7天后，CGF膜組的成骨相關蛋白ALP、Col-Ⅰ、OPN、Runx-2的蛋白表達均高于其它兩組，海奧膜組次之，空白組即基礎成骨誘導液組最低，與RT-PCR結果吻合。
　　結論:
　　1.hPDLSCs具有較強的增殖能力，表達間充質干