口腔粘膜下纖維性變相關miRNA表達譜的建立及其功能的初步探討.pdf

1、研究背景及目的:
　　口腔粘膜下纖維性變(oral submucous fibrosis,OSF)是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的口腔粘膜病,癌變率高達7.6％。最近的流行病學調查表明,OSF的發(fā)病地區(qū)、發(fā)病率和癌變率均有上升趨勢。目前認為OSF與咀嚼檳榔、膠原代謝紊亂、免疫、遺傳、微循環(huán)及血液流變學等因素有關,本課題組前期研究發(fā)現,丹參聯合小劑量潑尼松龍治療具有明顯的臨床效果,但口腔粘膜下纖維性變的確切發(fā)病機制及治療顯效獲得的

2、機制仍不清楚。
　　miRNA是近年來發(fā)現的轉錄后調節(jié)基因表達的內源性非編碼單鏈小RNA分子,參與了機體生長發(fā)育,器官形成,造血,細胞增殖、分化及凋亡等眾多生理活動和病理過程。近年來miRNA在心肌纖維化、腎臟纖維化和肝纖維化等方面已有許多報道,至于miRNA在OSF發(fā)病中的功能及機制研究報道較少。本研究旨在探討miRNA在OSF發(fā)病及臨床治療轉歸中的功能及作用機制,為闡明OSF的發(fā)病機理及臨床治療提供新的線索。
　　研究方

3、法:
　　(1)選取2例臨床上具有典型病理特征的中期OSF組織及其配對正常組織,以正常組織為對照,部分病變組織行Affvmetrix miRNA芯片實驗,建立OSF相關miRNA表達譜。原配對組織及選取的初診OSF配對中、晚期各10例組織經miRNA專用抽提試劑盒抽提miRNA后,經專用miRNA逆轉錄試劑盒逆轉錄后,用實時定量PCR驗證miRNA芯片結果。
　　(2)針對感興趣的miRNA,根據下列三個國際公認的、擁有不同

4、計算方法的數據庫:www.targetscan.org、pictar.mdc-berlin.de/cgibin/PicTar-vertebrate.cgi、www.mirbase.org進行miRNA靶標的初步預測,尋找三個數據庫都預測為靶的基因。
　　(3)從正?？谇徽衬そM織獲得原代成纖維細胞,以檳榔堿(50μg/ml)誘導,于24h,48h,72h檢測差異miRNA的表達。原代培養(yǎng)OSF-Fb細胞,經丹參(90mg/ml)聯合

5、小劑量潑尼松龍作用,于24h,48h,72h后檢測差異miRNA的表達。
　　(4)通過生物信息學軟件對miR-203可能調控的靶基因進行預測,結合其生物學功能,篩選出miR-203可能的靶基因COL4A4。Western blot檢測上述收集的配對標本組織、檳榔堿誘導前后的正?？谇徽衬こ衫w維細胞及丹參聯合小劑量潑尼松龍?zhí)幚砬昂蟮腛SF-Fb細胞中COL4A4的表達。
　　(5)將COL4A4基因3’UTR包括miR-203

6、結合位點、上下游部分側翼序列以及酶切位點在內的共60bp片段分別克隆入pMIR-REPORT熒光素酶報告基因載體,將其分別與β-gal表達質粒及miR-203表達載體共轉染293T細胞24h后檢測報告基因活性。
　　結果:
　　(1)所選病變組織屬于OSF病變中期,miRNA芯片顯示差異1.5倍以上的miRNA共有18個,其中OSF病變組織中上調12個,下調6個,miRNA特異性實時定量PCR驗證結果與芯片結果一致;

7、　　(2)臨床中、晚期OSF組織中差異miRNA的變化趨勢與芯片結果基本一致;(3)生物信息學分析結果顯示其中的miR-203、miR-23b及miR-200c等可能參與了OSF病變過程及其后的癌變;(4)檳榔堿能誘導正?？谇徽衬こ衫w維細胞中miRNA的表達改變,丹參聯合小劑量潑尼松龍能逆轉OSF成纖維細胞中相關miRNA的表達;(5)生物信息預測顯示COL4A4基因3’UTR與miR-203之間有一物種間保守作用位點(site1),3

8、個非保守作用位點(site2,site3,site4);(6)OSF組織中,COL4A4的蛋白表達量明顯高于配對正常組織,檳榔堿能誘導上調正?？谇徽衬こ衫w維細胞中COL4A4的表達,而丹參聯合小劑量潑尼松龍能下調OSF成纖維細胞中COL4A4的表達;(7)miR-203能明顯抑制site1介導的報告基因活性,能部分抑制site2與site4介導的報告基因活性,而對site3介導的報告基因活性無明顯影響。
　　結論:
　　(1