口腔粘膜下纖維性變發(fā)病相關(guān)基因的篩選與初步鑒定.pdf

1、口腔粘膜下纖維性變(oral submucous fibrosis，OSF)是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的口腔粘膜病，咀嚼檳榔是主要致病因素，OSF屬于口腔癌前狀態(tài)，癌變率高達(dá)7.6％。其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚?；蛐酒夹g(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展極大提高了我們對(duì)生物學(xué)研究和探討疾病分子機(jī)制的能力。其高通量、平行、微型化等顯著優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)受到世界各國(guó)科學(xué)家高度重視，并已廣泛用于腫瘤等多個(gè)領(lǐng)域研究。本研究采用Affymetrix U133A2.0

2、芯片構(gòu)建OSF粘膜組織的基因表達(dá)譜：以正?？谇徽衬そM織為對(duì)照，采用多種生物信息學(xué)方法篩選疾病差異表達(dá)基因；經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerasechain reation，RT-PCR)對(duì)部分候選基因進(jìn)行了驗(yàn)證，為進(jìn)一步探討OSF發(fā)生的分子機(jī)制和發(fā)現(xiàn)治療靶基因奠定基礎(chǔ)。 第一章口腔粘膜下纖維性變差異基因表達(dá)分析 目的：建立OSF的基因表達(dá)譜并篩選其差異表達(dá)基因。

3、方法：收集正常和OSF患者頰粘膜組織各4例，提取其總RNA并制備cDNA，合成生物素標(biāo)記的cRNA探針，經(jīng)GeneChip Test3驗(yàn)證了探針質(zhì)量合格后，與Affymetrix HG-U133A2.0寡核苷酸基因芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)過洗滌，掃描后用GeneChip Operating Software(GCOS)軟件讀取每一張芯片探針組中每一位點(diǎn)的表達(dá)值，扣除背景信號(hào)，自動(dòng)分析每一基因位點(diǎn)的表達(dá)參數(shù)并給出參考值，輸出數(shù)據(jù)，并利用dchip

4、2006軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，構(gòu)建出OSF組織的基因表達(dá)譜。再利用基因芯片顯著性分析(signficance analysis of microarray，SAM)中兩因素不配對(duì)算法計(jì)算假陽(yáng)性率，篩選出其OSF差異表達(dá)基因。 結(jié)果：芯片雜交結(jié)果符合質(zhì)量控制要求；按照q-value<0.05，以fold change>2或<0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到OSF差異表達(dá)基因共計(jì)865個(gè)，其中上調(diào)基因716個(gè)，下調(diào)基因149個(gè)。

5、 結(jié)論：在全基因組范圍內(nèi)建立了OSF的基因表達(dá)譜并篩選其差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步的發(fā)病機(jī)制研究和尋找OSF分子標(biāo)記物奠定了基礎(chǔ)。 第二章運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異表達(dá)基因的二次篩選 目的：運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析口腔粘膜下纖維性變差異表達(dá)基因，挖掘其隱含的生物學(xué)意義。 方法：利用多種生物信息學(xué)工具和軟件對(duì)前期篩選的865個(gè)OSF差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，GO分析、Pathway分析、染色體定位、遺傳關(guān)聯(lián)疾病分析和M

6、ILANO分析。 結(jié)果：聚類分析顯示所篩選的基因能很好區(qū)分正常組與病例組，其中最顯著的基因亞類為免疫相關(guān)基因。GO分析顯示差異表達(dá)基因主要參與免疫反應(yīng)，細(xì)胞粘附、炎癥反應(yīng)、DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程；大部分基因表達(dá)蛋白位于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)膜、膜或整合于膜上。119個(gè)基因?yàn)槲粗δ芑?，另外有大量的鈣鐵鋅結(jié)合分子，其他基因與受體激活和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)成等分子功能相關(guān)；Pathway分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與

7、抗原過程和呈遞、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、局部粘附、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子間相互作用、TGF-β信號(hào)通路等通路。染色體定位顯示差異表達(dá)基因主要定位于1、2、5、6、7、11和12號(hào)染色體上(P<0.01)；而與這些基因有遺傳關(guān)聯(lián)的疾病主要有感染，免疫和心血管疾病等。MILANO分析顯示大部分在纖維化疾病和腫瘤中研究廣泛的基因在OSF中未曾研究。 結(jié)論：運(yùn)用生物信息學(xué)工具可快速、平行地分析大量的基因芯片數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)差異基因初步的功能

8、歸類，為OSF的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)研究提供新的思路。 第三章半定量RT-PGR對(duì)部分差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 目的：篩選和驗(yàn)證候選基因，并初步探討其在OSF中的作用。 方法：根據(jù)多種生物信息學(xué)方法和文獻(xiàn)復(fù)習(xí)確定候選基因；抽提11例口腔粘膜下纖維化組織和10例正?？谇徽衬そM織的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)候選基因在口腔粘膜下纖維性變患者頰粘膜和正常頰粘膜中rnRNA的表達(dá)。 結(jié)果：挑選出6個(gè)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)