IGF-1在甲狀腺相關(guān)眼病眼眶脂肪增殖中的作用及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的：
　　在甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associatedophthalmopathy,TAO)患者眼眶脂肪基質(zhì)細(xì)胞(orbitaladipose-derivedstromalcell，OADSC)體外分離和培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，研究胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)對(duì)TAO患者OADSC增殖的影響，以及IGF-1在TAO患者OADSC向成熟脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，并進(jìn)一步探討其

2、相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，為深入研究TAO患者眼眶脂肪組織異常增殖的影響因素以及TAO的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，希望有助于為T(mén)AO的治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IGF-1蛋白在TAO患者和正常人眼眶脂肪組織中的表達(dá)。
　　2.膠原酶消化法分離TAO患者OADSC，并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物;成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)OADSC細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分

3、化;采用油紅O對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行染色。
　　3.CCK-8法檢測(cè)IGF-1對(duì)TAO患者OADSC細(xì)胞增殖的影響，包括:(1)10ng/mlIGF-1作用于OADSC，檢測(cè)第1天至第6天細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化;(2)不同濃度的IGF-1(0、1、10、20、100、200ng/ml)作用于OADSC，檢測(cè)72小時(shí)后細(xì)胞的增殖情況。
　　4.IGF-1作用于TAO患者OADSC細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)分化后采用油紅O對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色;倒置相差顯

4、微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的變化情況，并應(yīng)用酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量進(jìn)行半定量測(cè)定。
　　5.IGF-1作用于TAO患者OADSC，成脂誘導(dǎo)分化10天后，real-timePCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)、脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocytefattyacidbindingprotein，AP2)及脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase，F(xiàn)AS)mRNA水平的變化。
　　6.

5、Westernblot檢測(cè)IGF-1作用于TAO患者OADSC1小時(shí)后，細(xì)胞磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)、總Akt蛋白水平的變化;檢測(cè)IGF-1作用于TAO患者OADSC，成脂誘導(dǎo)分化10天后，促進(jìn)脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄因子—過(guò)氧化物酶增殖物活化受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma，PPARγ)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫

6、組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:IGF-1蛋白在TAO患者組眼眶脂肪組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為26.33％;在正常人組眼眶脂肪組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為13.25％。
　　2.從TAO患者眼眶脂肪組織標(biāo)本中成功地分離得到了OADSC細(xì)胞，并能在體外進(jìn)行穩(wěn)定地原代和傳代培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)果顯示:CD29(+)、CD44(+)、CD31(-)、CD45(-);成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化10天后，細(xì)胞內(nèi)有脂質(zhì)堆

7、積并能被油紅O染為紅色。
　　3.IGF-1(10ng/ml)促進(jìn)了TAO患者OADSC細(xì)胞生長(zhǎng)(第2天至第6天，p＜0.05);不同濃度IGF-1作用于TAO患者OADSC細(xì)胞72小時(shí)后，與對(duì)照組相比，1ng/mlIGF-1沒(méi)有明顯地促進(jìn)細(xì)胞增殖（p＞0.05），而10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/mlIGF-1均促進(jìn)了細(xì)胞增殖(p＜0.01），并且100ng/mlIGF-1對(duì)OADSC生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

8、最明顯(p＜0.05）。
　　4.三組TAOOADSC細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化10天后，油紅O染色，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況。結(jié)果顯示:IGF-1組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量最多，不含IGF-1組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量最少（較IGF-1組約減少50％），IGF-1+αIR3組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量居中（較IGF-1組約減少40-45％）。
　　5.IGF-1作用于TAO患者OADSC細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化10天后，real-timePCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因mRNA

9、的表達(dá):脂聯(lián)素、瘦素、脂肪酸結(jié)合蛋白、脂肪酸合成酶mRNA分別為對(duì)照組的6.8±1.4倍、7.3±0.7倍、2.7±0.7倍和4.0±0.6倍;IGF-1對(duì)TAO患者OADSC細(xì)胞的這一促進(jìn)效應(yīng)能被αIR3（IGF-1受體的阻斷性抗體）或LY294002（PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路特異性抑制劑）顯著抑制。
　　6.IGF-1(10ng/ml)作用于TAOOADSC細(xì)胞1小時(shí)后，磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt

10、)蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，但總Akt蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化;IGF-1(10ng/ml)作用于TAOOADSC細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化10天后，PPARγ蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組增高;上述兩種效應(yīng)能均能被αIR3或LY294002所抑制。
　　結(jié)論：
　　1.IGF-1蛋白在TAO患者組眼眶脂肪組織中的表達(dá)水平較正常人組高。
　　2.應(yīng)用膠原酶消化法可以分離得到原代TAO患者OADSC細(xì)胞，并且能在體外進(jìn)行穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)和擴(kuò)增，建立供

11、進(jìn)一步研究的體外細(xì)胞模型。
　　3.通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)志物分析提示，TAO患者OADSC細(xì)胞是一組間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞;該細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液的作用下可向成熟脂肪細(xì)胞分化。
　　4.IGF-1能顯著地促進(jìn)TAO患者OADSC細(xì)胞增殖和成脂誘導(dǎo)分化，并增加成脂誘導(dǎo)分化后細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積。
　　5.IGF-1經(jīng)由IGF-1受體(IGF-1R)和PI3K細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路上調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)TAO患者OADSC向成熟脂肪