外源性生長(zhǎng)激素與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究.pdf

1、肝癌是一種高消耗性疾病，患者通過(guò)機(jī)體組織的分解為肝癌的生長(zhǎng)提供能量和底物。因此，肝癌患者大多存在異常代謝旺盛、營(yíng)養(yǎng)不良等情況，晚期常發(fā)展成為惡病質(zhì)。重組人生長(zhǎng)激素（recombinant hunman growth hormone，rhGH）具有代謝調(diào)理和免疫調(diào)節(jié)作用，可以改變腫瘤患者的異常代謝狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，從而達(dá)到改善腫瘤患者營(yíng)養(yǎng)狀況的目的。但由于rhGH具有促細(xì)胞增殖的作用,因此rhGH應(yīng)用于腫瘤患者的安全性一直受到質(zhì)疑。使

2、用rhGH是否會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制如何是臨床亟待解決的重要課題。 目的： 本課題以rhGH對(duì)高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H生物學(xué)行為的影響為切入點(diǎn)，研究rhGH體外對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等行為的影響；并通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（insulin like growth factor-1 receptor，IGF1R），研究生長(zhǎng)激素／胰島素樣生長(zhǎng)

3、因子－1（growth hormone /insulin like growth factor-1，GH/IGF-1）軸被阻斷后rhGH對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為影響的變化；探索GH/IGF-1軸后續(xù)與肝癌細(xì)胞凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索rhGH對(duì)裸鼠肝癌成瘤原位肝癌移植瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。研究結(jié)果將為闡明rhGH是否能安全應(yīng)用于肝癌患者臨床治療提供理論依據(jù)。 方法： 構(gòu)建RN

4、A干擾IGF1R真核表達(dá)載體，以pGCsi-U6-Neo-GFP為空白質(zhì)粒載體，以IGF1R為靶基因,按GenBank IGF1R基因核苷酸序列和TuschI設(shè)計(jì)原則,選擇5對(duì)2條互補(bǔ)的帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列,連接到pGCsi-U6-Neo-GFP空載體中。轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞（293T），進(jìn)行RT-PCR及Western-blot檢測(cè)，篩選出沉默效果最好的RNA干擾IGF1R真核表達(dá)載體。再轉(zhuǎn)染MHCC-97H肝癌細(xì)胞株，G418篩選并建立I

5、GF1R基因穩(wěn)定低表達(dá)的MHCC-97H肝癌細(xì)胞株。用無(wú)血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株凋亡，采用終濃度為25、50、100、500ug/L的rhGH完全培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)。觀察rhGH對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)狀況的影響；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)rhGH對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株凋亡及細(xì)胞周期的影響；通過(guò)體外粘附及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rhGH對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株體外粘附及侵襲能力的影響；Western-blot法檢測(cè)磷脂酰肌醇

6、-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3K)和整合素兩條信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子絲氨酸-蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）和局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達(dá)與磷酸化水平的改變。建立裸鼠皮下和原位肝癌移植模型，研究IGF1R基因沉默前后裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力，以及IGF1R沉默后rhGH對(duì)裸鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。

7、 結(jié)果： 構(gòu)建的RNA干擾IGF1R真核表達(dá)載體經(jīng)酶切和DNA測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)完全一致。成功篩選出IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌細(xì)胞。經(jīng)RT-PCR及Western-blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)IGF1R沉默效率分別為85.9％和80.21％。rhGH干預(yù)后IGF1R表達(dá)正常的MHCC-97H肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較對(duì)照組明顯升高。在濃度為25ug/L、50ug/L、100ug/L的 rhGH干預(yù)下IGF1R表達(dá)正常的MHCC-97H

8、肝癌細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，PI指數(shù)升高，細(xì)胞凋亡降低，MHCC-97H肝癌細(xì)胞粘附于96孔板和穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)；但rhGH濃度升至500ug/L后MHCC-97H肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線反而下降，細(xì)胞凋亡增加、穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。IGF1R基因沉默后MHCC-97H肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯著下降、粘附及穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05

9、)；再以rhGH干預(yù)后MHCC-97H肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯抬高、凋亡無(wú)顯著降低、粘附于96孔板及穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著增加（P>0.05）。以Western-blot檢測(cè)信號(hào)分子AKT、FAK的蛋白表達(dá)和磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，rhGH作用后pATK和pFAK磷酸化顯著增加(P<0.05)，IGF1R沉默后再加用rhGH，除較高濃度外，其余各組pATK和pFAK表達(dá)無(wú)明顯增加（P>0.05）。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)rhGH注射可以

10、使荷瘤裸鼠體重明顯增加，肝癌移植瘤體積顯著增大，（P<0.05）。但MHCC-97H肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移并無(wú)顯著增加。IGF1R基因沉默后裸鼠皮下移植瘤的成瘤率、原位肝癌接種模型中的肝癌移植瘤的體積顯著減小，（P<0.05）。再加用rhGH后其對(duì)裸鼠肝癌移植瘤的體積增大無(wú)顯著促進(jìn)作用，（P>0.05）。 結(jié)論： 濃度為25ug/L、50ug/L、100ug/L的 rhGH在體外可以促進(jìn)MHCC-97H肝癌細(xì)胞株增殖、

11、抑制其凋亡、并對(duì)其體外粘附及侵襲能力具有顯著促進(jìn)作用。但rhGH濃度升至500ug/L后MHCC-97H肝癌細(xì)胞增殖、侵襲能力反而降低，細(xì)胞凋亡增加。RNA干擾IGF1R真核表達(dá)載體能夠有效沉默MHCC-97H肝癌細(xì)胞株IGF1R基因表達(dá)。IGF1R基因沉默后rhGH對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞的促進(jìn)生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用減弱，抑制凋亡的能力下降。對(duì)AKT與FAK的研究表明，rhGH可能通過(guò)激活PI-3K和整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)分別抑制MH