ALI-ARDS治療的新途徑：腎素-血管緊張素系統(tǒng).pdf

1、目的： 由于目前尚無特異有效的治療方法，急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）的死亡率一直居高不下。最近，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system，RAS）引起關(guān)注，有證據(jù)提示RAS與ALI/ARDS存在重要關(guān)聯(lián)。為系統(tǒng)研究RAS與ALI/ARDS的關(guān)系，我們首先建立盲腸結(jié)扎穿孔

2、術(shù)（Cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)的ALI/ARDS動物模型，以觀察ALI/ARDS中RAS系統(tǒng)的變化規(guī)律，并通過干預(yù)RAS系統(tǒng)觀察動物病情和預(yù)后的改變；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究RAS藥物氯沙坦干預(yù)ALI/ARDS炎癥反應(yīng)通路的機(jī)制；同時，還觀察ALI/ARDS模型的血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，并在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證氯沙坦干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）凋亡的作用。期望通過這一系列的實(shí)驗(yàn)，為ALI/ARDS治療

3、探索新的途徑。 研究內(nèi)容和方法： 第一部分：ALI/ARDS動物模型中RAS系統(tǒng)的變化 建立CLP誘導(dǎo)的ALI/ARDS動物模型，在手術(shù)后18小時觀察小鼠的癥狀、血?dú)夥治?、肺濕，干重比（W/D）和肺組織病理等指標(biāo)；采用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）和放射免疫等方法研究ALI/ARDS動物模型中RAS系統(tǒng)幾種關(guān)鍵酶（ACE、ACE2和AngⅡ）的變化規(guī)律。 第二部分：RA

4、S藥物對ALI/ARDS的影響 小鼠ALI/ARDS模型復(fù)制成功后，分別給小鼠腹腔注射卡托普利（ACE拮抗劑）、重組小鼠ACE2（recombinant mouse ACE2，rm ACE2）和氯沙坦（AngⅡ的AT1受體阻滯劑），觀察它們對ALI/ARDS動物的影響，在此基礎(chǔ)上，著重觀察RAS下游阻滯劑氯沙坦對ALI/ARDS的治療效果。 第三部分：氯沙坦治療ALI/ARDS的可能機(jī)制 收集假手術(shù)組、手術(shù)組和氯

5、沙坦組的小鼠肺組織，分別提取肺組織細(xì)胞胞漿蛋白和胞核蛋白，采用Western blotting方法檢測胞漿IκB-α表達(dá)的變化，采用電泳遷移率變動分析實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）檢測胞核中NF-κB的表達(dá)變化；另外提取肺組織總蛋白，采用Western blotting方法檢測肺組織中絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK

6、）信號通路的變化（包括ERK1/2、p38和JNK）。 第四部分：氯沙坦對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 先用透視電鏡觀察ALI/ARDS肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化，提示ALI/ARDS病理變化中存在血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化；在此基礎(chǔ)上，在體外培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），培養(yǎng)成功后先用AngⅡ刺激細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞的凋亡率；然后再加入氯沙坦與AngⅡ共同作用于HUVEC，再次測定細(xì)胞的凋亡率，評價氯沙坦對血管內(nèi)皮細(xì)

7、胞的保護(hù)作用。 研究結(jié)果： 第一部分：ALI/ARDS動物模型中RAS系統(tǒng)的變化 1、CLP能夠誘導(dǎo)小鼠在手術(shù)后18小時出現(xiàn)典型的ALI/ARDS改變，手術(shù)組較假手術(shù)組小鼠肺水含量明顯增多（W/D：6.08±0.64 vs4.38±0.93，P<0.01），明顯缺氧（PaO2：40.8±5.03 vs72.8±4.32，P<0.01），氧合指數(shù)明顯下降（PaO2/FiO2：194.3±23.9 vs346.7±2

8、0.5，P<0.01），且肺組織病理出現(xiàn)明顯的肺損傷改變。 2、Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，ALI/ARDS小鼠肺組織的ACE2表達(dá)下降；而ACE則沒有明顯差異，手術(shù)組和假手術(shù)組肺組織中ACE蛋白量均很高。 3、在ALI/ARDS小鼠肺組織和血漿中AngⅡ的量均明顯增高，而且加入相關(guān)RAS藥物后AngⅡ出現(xiàn)變化；與手術(shù)組比較，卡托普利（ACE拮抗劑）和rmACE2（重組小鼠ACE

9、2）都能不同程度的抑制體內(nèi)AngⅡ的生成（肺，1.58±0.16，1.65±0.21 vs2.38±0.41；血，178.04±17.87，153.74±10.24 vs213.38±25.44）。 第二部分：RAS藥物對ALI/ARDS的影響 1、與手術(shù)組比較，卡托普利組小鼠肺W/D明顯降低（5.35±0.25 vs6.06+0.22，P<0.05），rmACE2組與手術(shù)組的W/D比較雖然無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但也出現(xiàn)下降

10、趨勢（5.61±0.59 vs6.06±0.22，P=0.096）。相比而言，氯沙坦能更顯著的減少ALI/ARDS小鼠肺W/D（5.35±0.25 vs6.06±0.22，P<0.01）。 2、氯沙坦改善肺損傷的程度是與其濃度有關(guān)的，在5mg/kg至15mg/kg的范圍內(nèi)，ALI/ARDS小鼠的氧合指數(shù)和W/D均得到改善，其改善程度隨氯沙坦的濃度增加而增加，但當(dāng)氯沙坦的濃度超過15mg/kg時，氧合指數(shù)和W/D反而逐漸變差，氯沙

11、坦?jié)舛葹?5mg/kg時治療ALI/ARDS效果最好。 3、氯沙坦能抑制ALI/ARDS小鼠血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，減輕肺損傷，且能一定程度的改善小鼠7天生存率。 第三部分：氯沙坦治療ALI/ARDS的可能機(jī)制 1、CLP手術(shù)誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠肺組織胞漿中的IκB-α減少，而胞核NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng)；腹腔注射氯沙坦后，小鼠IκB-α降解程度減少，相應(yīng)的，細(xì)胞核活化的NF-

12、κB也減少了。 2、在CLP手術(shù)誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠肺組織中，ERK1/2、JNK和p38的磷酸化明顯增強(qiáng)，而增加氯沙坦后MAPK磷酸化得到不同程度的抑制。 第四部分：氯沙坦對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 1、CLP誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫或溶解，核周間隙分離增寬，內(nèi)皮細(xì)胞間連接增寬。 2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial ce

13、ll，HUVEC）加入AngⅡ刺激24小時后，細(xì)胞凋亡呈濃度依賴型，AngⅡ（10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l）的細(xì)胞凋亡率分別是7.85%、9.96%和10.4%。加入10-6mol/l氯沙坦后，HUVEC凋亡率得到改善，細(xì)胞凋亡率分別變?yōu)椋?.95%、8.62%、8.67%。 結(jié)論： 1、CLP誘導(dǎo)的ALI/ARDS存在RAS系統(tǒng)激活，表現(xiàn)為機(jī)體AngⅡ含量明顯增加。 2、RAS系統(tǒng)

14、中ACE和ACE2對AngⅡ生成有不同的調(diào)節(jié)作用，ACE起正調(diào)節(jié)作用而ACE2起負(fù)調(diào)節(jié)作用；卡托普利和rmACE2都能在一定程度上減少AngⅡ的分泌，改善肺損傷。 3、AngⅡ的AT1受體阻滯劑氯沙坦能夠明顯改善CLP誘導(dǎo)的ALI/ARDS癥狀，減輕肺損傷，并能提高7天生存率。 4、氯沙坦治療ALI/ARDS的可能機(jī)制：干預(yù)NF-κB和MAPK信號通路，減輕ALI/ARDS的全身性炎癥反應(yīng)。 5、CLP誘導(dǎo)的AL