大豆生物活性肽功能研究-Lunasin原核表達(dá)純化及活性鑒定.pdf

1、大豆生物活性肽Lunasin是1987年日本的一個研究小組從大豆中分離鑒定的一個天然多肽，全長43個氨基酸殘基，分子量5kDa。分子內(nèi)含有一個細(xì)胞粘附序列Arg-Gly-Asp (RGD)，此序列可與細(xì)胞外基質(zhì)相連；Lunasin的C 末端含有8個天門冬氨酸殘基，此結(jié)構(gòu)與多肽的抗有絲分裂效應(yīng)相關(guān)，可以結(jié)合到去乙酰化的染色質(zhì)區(qū)（如，著絲粒），導(dǎo)致有絲分裂中止而最終引起細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，Lunasin 具有抑制結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的功

2、能。該多肽具有抗炎作用，可以通過抑制NF-κB 通路來抑制炎癥進(jìn)程。由于Lunasin 具有特殊結(jié)構(gòu)和功能，因此對Lunasin的研究具有重要意義。
　　 Lunasin在天然原料中的含量很低，因此直接提取純化程序復(fù)雜且成本高。所以本研究以Lunasin的基因序列為依據(jù)，人工合成基因寡聚核苷酸序列，通過酶切、連接將Lunasin基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，得到重組載體pET-32a(+)-Lunasin-6Hi

3、s，然后將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。通過對誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)工程菌在30℃，0.05mM IPTG 誘導(dǎo)4h后可溶性表達(dá)。經(jīng)過經(jīng)Sephrose－鎳親和層析柱純化，并由SDS-PAGE和Western Blot 鑒定表達(dá)產(chǎn)物為6kDa的帶六個組氨酸(6His)標(biāo)簽的融合蛋白。并利用巨噬細(xì)胞RAW264.7 檢驗(yàn)其生物活性。通過原核表達(dá)的方法表達(dá)純化Lunasin的優(yōu)點(diǎn)是流程短、操作簡單方便、成本較低、技術(shù)成熟穩(wěn)定