黑斑蛙皮膚生物活性肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性檢測(cè).pdf

1、兩棲動(dòng)物是最原始的陸生脊椎動(dòng)物,既有適應(yīng)陸地生活的新的性狀,又有從魚類祖先繼承下來(lái)的適應(yīng)水生生活的性狀。兩棲類動(dòng)物皮膚裸露,為了適應(yīng)復(fù)雜多樣的生態(tài)環(huán)境并維持自身的生存,皮膚起到重要作用。兩棲類皮膚可以分泌大量功能復(fù)雜、種類繁多的生物活性物質(zhì),對(duì)抵御有害環(huán)境因子侵襲有著重要作用。蛙類皮膚活性肽資源豐富包括抗菌肽、舒緩激肽樣多肽、血管緊張素因子、多肽生長(zhǎng)因子、嗎啡因子、保濕因子等。生物活性多肽具有分子和功能的多樣性。兩棲類皮膚資源豐富,可用

2、于生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)、純化和功能研究。黑斑蛙(Rana nigromaculata)屬于蛙科、蛙屬,廣泛分布在我國(guó)各地,資源豐富。
　　 本論文選取遼寧省大連市金州登沙河鎮(zhèn)的黑斑蛙為實(shí)驗(yàn)材料,運(yùn)用反相高效液相色譜技術(shù)對(duì)黑斑蛙皮膚分泌物中生物活性多肽進(jìn)行提取和純化,獲得6種皮膚生物活性肽。利用MS和Q-TOF MS／MS對(duì)6種多肽的分子量和氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定。首先利用電刺激誘導(dǎo)方法取得黑斑蛙的皮膚分泌液。采用VydacTP510

3、反相高效液相色譜,對(duì)皮膚分泌液采用線性梯度洗脫,分離純化得到6個(gè)多肽。6條多肽分子量從1060.2到3245.9道爾頓,由9個(gè)到32個(gè)氨基酸組成。其一級(jí)結(jié)構(gòu)分別為RPPGFSPFR、RPPGFSDSSPLAPGT、LKNVGKEVGFDVENELRLAGHARPLGK、KSPGVGALAGKKPHGLLLSGLKNVGGAEAGFD、LGLGKVLGVGQRALAHSPPK、和LVPLVSYHLPVL。通過(guò)比對(duì)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),由9

4、個(gè)氨基酸組成的多肽RPPGFSPFR是典型緩激肽(Bradykinin),命名為Bradykinin-RN;RPPGFSDSSPLAPG工具有緩激肽的結(jié)構(gòu)域保守序列RPPGFS-,屬于緩激肽相關(guān)肽BRPs(Bradykinin-related peptides),命名為Ranakinin-RN1。LVPLVSYHLPVL雖然不含有緩激肽的保守序列,但具有較高的緩激肽活性,所以命名為Ranakinin-RN2,而其余多肽同已知其它兩棲類皮

5、膚多肽相似度很低,屬于新的多肽,分別命名為:Nigromin-1,Nigromin-2和Nigromin-3?？咕钚詼y(cè)定結(jié)果顯示,這3個(gè)新肽對(duì)2種細(xì)菌均沒有抑制作用。對(duì)3個(gè)緩激肽和緩激肽相關(guān)肽進(jìn)行豚鼠離體回腸實(shí)驗(yàn)測(cè)定對(duì)腸肌收縮性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bradykinin-RN和Ranakinin-RN1豚鼠回腸的收縮強(qiáng)度呈現(xiàn)一個(gè)正的線性關(guān)系,Bradykinin-RN的緩激肽活性比緩激肽Ranakinin-RN1強(qiáng)。Ranakinin-