人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)的原核表達、純化及生物活性檢測.pdf

1、目的：
　　 1、建立gAd基因原核表達體系2、基因重組gAd蛋白的表達3、基因重組gAd蛋白的純化4、對基因重組gAd蛋白的生物活性進行檢測。
　　 方法：本研究首先從健康人全血中抽提基因組DNA，從Genbank獲取脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域的基因序列，設(shè)計引物在上游引物中加入EcoRⅠ酶切位點和起始密碼，在下游引物中加入6個組氨酸，終止密碼和PstⅠ酶切位點，對目的片段進行PCR擴增，把擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、純化后克隆入經(jīng)Ec

2、oRⅠ和PstⅠ雙酶切并純化后的pBV220載體，該重組質(zhì)粒命名為pBV220-gAd，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選出陽性菌株，提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定后測序。酶切和測序結(jié)果正確后對JM109/pBV220/gad表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達，該系統(tǒng)可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和誘導(dǎo)條件下4-5h內(nèi)表達gad蛋白占菌體總蛋白的28％，表達的量較高，免疫學(xué)鑒定結(jié)果表明該異源重組蛋白具有His-tag抗原活性。gad蛋白純化方法采用固定金屬親和層析(IMA

3、C)的方法，使用TALON Metal Affinity后，采用咪唑梯度洗脫的方法對gad蛋白進行了純化，免疫學(xué)鑒定結(jié)果表明純化后的重組蛋白具有His-tag抗原活性。純化后的gAd蛋白經(jīng)復(fù)性腹腔注射于糖尿病鼠模型，與對照組比較血糖下降顯著，證明重組gad蛋白具有生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果：從健康人全血中提取出可用于PCR擴增的基因組DNA，以提取獲得的基因組DNA為模板，進行PCR，擴增出與理論的gAd基因片段414bp大小基本

4、相符的gAd基因片段，與經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切并純化后的pBV220載體連接，構(gòu)建了pBV220-gAd質(zhì)粒表達載體，經(jīng)雙酶切鑒定目的片段與理論大小一致，經(jīng)測序證實該序列與基因庫中報道的完全一致，說明成功構(gòu)建了pBV220-gAd表達載體。
　　 JM109/pBV220/gad表達系統(tǒng)屬于PRPL串聯(lián)雙啟動子的高效原核基因表達系統(tǒng)，實驗結(jié)果證實pBV220-gAd/JM109在30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期時菌密度A600為0.

5、6左右進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)5h，目的蛋白獲得較高的表達量，其表達量占菌體總蛋白總量的28％，免疫學(xué)鑒定結(jié)果表明該異源重組蛋白具有His-tag抗原活性。固定金屬親和層析(IMAC)是近年來發(fā)展起來的一種親和方法，其固定相基質(zhì)上鰲合了一些金屬離子，如Co2+、Ni2+、Fe3+等，其配基為側(cè)鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結(jié)構(gòu)最易結(jié)合到金屬離子親和柱上，純化效

6、果較好。本課題中，的設(shè)計是基于其N端設(shè)計有6個His組成的His標(biāo)簽。His的咪唑環(huán)作為電子供體容易與固定的金屬離子形成配位鍵，含有連續(xù)His殘基序列的多肽可在IMAC基質(zhì)中有效保留?；|(zhì)材料洗滌之后可通過添加游離咪唑洗脫含多聚His的多肽。本實驗用TALONMetalAffinityResin純化后獲得gAd蛋白經(jīng)SDS-PAGE顯示單一條帶，表明pBV220-gAd/JM109菌體蛋白經(jīng)TALONMetalAffinityResin

7、純化后獲得gAd融合蛋白的純品，免疫學(xué)鑒定結(jié)果表明純化后的重組蛋白具有His-tag抗原活性。
　　 通過對實驗組和對照組糖尿病大鼠重組gAd蛋白治療前和治療后禁食8h后空腹血糖的比較實驗，證實重組gad蛋白具有降低糖尿病大鼠血糖的生物學(xué)作用。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pBV220-gAd原核表達載體；經(jīng)誘導(dǎo)獲得目的蛋白高表達，經(jīng)純化獲得了較純的gAd蛋白，經(jīng)動物實驗檢測具有降低血糖的生物學(xué)活性。本研究為進一步將gAd蛋白