日本血吸蟲轉(zhuǎn)化生長因子的鑒定及其與日本血吸蟲病性肝纖維化的關(guān)系.pdf

1、日本血吸蟲病是一種具有寄生性、地方性、自然疫源性、嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患型寄生蟲病。宿主接觸到含有尾蚴的疫水后，尾蚴可鉆皮進(jìn)入宿主體內(nèi)并轉(zhuǎn)化為童蟲，童蟲在體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育，待性器官成熟后雌雄合抱，移行至門脈-腸系膜靜脈系統(tǒng)定居并交配產(chǎn)卵，蟲卵主要沉積在腸壁組織和肝臟組織內(nèi)。沉著于組織內(nèi)的蟲卵的卵細(xì)胞約經(jīng)11天即發(fā)育成毛蚴。由于成熟蟲卵內(nèi)毛蚴的分泌物可透過卵殼，引起蟲卵周圍組織和血管壁發(fā)生炎癥壞死繼而形成蟲卵肉芽腫和肝纖維化，因此，蟲卵

2、是導(dǎo)致慢性血吸蟲病甚至發(fā)展為晚期血吸蟲病的主要致病因素。 血吸蟲與宿主相互作用，采用分子/抗原偽裝、模擬，合成神經(jīng)性分子和抑制宿主免疫效應(yīng)的物質(zhì)等方式參與免疫逃避，同時(shí)血吸蟲體表還分布著某些能和宿主分子相結(jié)合的受體，利用宿主免疫反應(yīng)所提供的某些效應(yīng)分子如轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1），促進(jìn)自身的發(fā)育、成熟和生殖。在多種細(xì)胞因子中，TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的肝纖維化促

3、進(jìn)因子之一。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，脂質(zhì)過氧化物的活化可促使HSC釋放大量TGF-β1，TGF-β1反過來又引起HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的產(chǎn)生，另外，TGF-β1還可促使竇狀內(nèi)皮細(xì)胞對纖溶酶原激活因子抑制劑合成增多、抑制HSC合成膠原蛋白酶、促使HSC表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）等抑制ECM的正常降解。大

4、量間質(zhì)膠原和其他ECM成分，首先沉積于Disse間隙，最終導(dǎo)致肝纖維化。TGF-β1亦是一種免疫抑制因子，可對細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫中起著免疫抑制作用。 TGF-β超家族由一類結(jié)構(gòu)和功能都相似的多肽生長因子亞家族組成，其中TGF-β亞家族是成員之一，包括TGF-β1～6，在哺乳動物中表達(dá)并已克隆的有TGF-β1～3，種屬間具有高度的同源性。TGF-β1可以以有活性或無活性的形式存在于機(jī)體中，活化后的TGF-β1與細(xì)胞

5、膜上的特異受體結(jié)合通過Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。由于它在各物種間高度保守，故推測在日本血吸蟲中亦可能存在TGF-β1基因，在日本血吸蟲病性肝纖維化的形成方面起著一定的作用。 研究目的： 在本課題組已克隆、表達(dá)的SjTGF-β1成熟肽的基礎(chǔ)上，通過RACE方法獲得SjTGF-β1基因cDNA序列。利用生物學(xué)信息技術(shù)對所獲得的序列進(jìn)行理論分析和功能預(yù)測；原核克隆、表達(dá)SjTGF-β1部分cDNA序列，并對表達(dá)的蛋白

6、行免疫反應(yīng)性分析；對該基因在蟲體生長的各個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平、表達(dá)水平進(jìn)行檢測，以初步確定在日本血吸蟲中是否存在TGF-β1基因；同時(shí)檢測在日本血吸蟲感染小鼠不同時(shí)期肝臟的TGF-β1表達(dá)水平，以及在不同感染階段小鼠血漿中的TGF-β1，初步探討蟲源性和宿主源性的TGF-β1在日本血吸蟲致宿主肝纖維化過程中的作用。 研究方法： （1）SjTGF-β1成熟肽序列已由本課題組朱郇憫碩士擴(kuò)增完成，SjTGF-β1基因序列由上海英駿

7、生物技術(shù)（Invitrogen）有限公司通過RACE方法擴(kuò)增獲得。利用GeneBank，ExPASy等對該基因序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，設(shè)計(jì)特異性引物，將成蟲總RNA進(jìn)行RT-PCR以擴(kuò)增獲得SjTGF-β1基因片段，采用TA克隆的方法并將該片段亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a（+），構(gòu)建pET28a（+）-SjTGF-β1重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）以建立pET28a（+）-SjTGF-β1重組工程菌株。利用PCR、酶切

8、和測序方法對重組質(zhì)粒鑒定，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，獲得重組工程菌株高效表達(dá)的目的蛋白，并對該蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)性檢測。 （2）采用熒光定量PCR技術(shù)，利用特異性引物分析SjTGF-β1基因在尾蚴、蟲卵、雌、雄成蟲和Sj感染小鼠各個(gè)時(shí)期肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平； （3）利用Western Blot技術(shù)檢測Sj雌、雄成蟲中是否表達(dá)TGF-β1蛋白，以及Sj感染各期小鼠肝臟中SjTGF-β1和小鼠TGF-β1的表達(dá)水平。 （

9、4）利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)分析Sj感染小鼠體內(nèi)總TGF-β1的表達(dá)水平。 研究結(jié)果： （1）將獲得的SjTGF-β1核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對（Blastn）和分析，發(fā)現(xiàn)其中777bp大小的片段與小鼠及人的同一性（identity）分別為85%、89%；氨基酸序列與小鼠及人的同一性分別為88%、92%；功能結(jié)構(gòu)域

10、序列與小鼠及人的同一性為99%和100%，具有高度的同源性。該蛋白的分子量（MW）為29.8kDa，等電點(diǎn)（PI）為8.61，是一堿性蛋白，具有與小鼠相似的親水性線性抗原表位。利用蛋白功能結(jié)構(gòu)檢索的方法發(fā)現(xiàn)它具有TGF-β前導(dǎo)肽的部分序列和TGF-β功能結(jié)構(gòu)域的完整序列，用同源建模的方法發(fā)現(xiàn)該蛋白的空間構(gòu)象與小鼠的完全一致。 （2）成功構(gòu)建了pET28a（+）-SjTGF-β1原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可在大腸桿菌BL21（

11、DE3）中表達(dá)了重組融合蛋白，主要以包涵體的形式存在，重組菌和包涵體的蛋白條帶均可被兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體所識別。 （3）將Sj和小鼠的TGF-β1核苷酸序列比對后，在兩者有差異的cDNA區(qū)域設(shè)計(jì)各自的特異性引物，分別以Sj和小鼠的cDNA為模板進(jìn)行特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，以SjcDNA為模板、用SjTGF-β1引物擴(kuò)增和以小鼠cDNA為模板、用小鼠TGF-β1引物擴(kuò)增時(shí)，均分別得到約250bp的特異性PCR產(chǎn)物，以SjcDNA

12、為模板、用小鼠TGF-β1引物擴(kuò)增及以小鼠cDNA為模板、用SjTGF-β1引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，無特異性條帶，確定TGF-β1基因在日本血吸蟲雌、雄蟲中特異性轉(zhuǎn)錄。 （4）利用熒光定量PCR技術(shù)檢測SjTGF-β1基因在尾蚴、蟲卵、雌、雄成蟲期均有轉(zhuǎn)錄；在肝組織中蟲體感染早期的轉(zhuǎn)錄水平高，感染21天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平降低，隨著感染時(shí)間的延長和疾病慢性化的進(jìn)程，第8周時(shí)降至最低，第12周時(shí)又逐漸上升，感染晚期又恢復(fù)至高水平。 （5）W

13、estern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分子量約為50kDa附近，雌、雄成蟲和各期感染小鼠的肝臟中均有一目的條帶的出現(xiàn)，該條帶可能為TGF-β1的無活性潛在相關(guān)肽（LAP），且雄蟲的表達(dá)高于雌蟲，小鼠感染后期表達(dá)更為顯著。 （6）利用ELISA技術(shù)檢測感染小鼠血漿中總TGF-β1的水平隨著感染時(shí)間的延長而升高。 （7）免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)正常組小鼠肝組織切片有少量的TGF-β1表達(dá)，在感染小鼠的肝臟組織中，TGF-β1的表達(dá)水平

14、隨著感染時(shí)間的延長表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)。感染后期，蟲卵肉芽腫周圍、匯管區(qū)附近的TGF-β1的表達(dá)更高。 結(jié)論： （1）已獲得SjTGF-β1基因部分核苷酸序列長約777bp，其編碼258個(gè)氨基酸，具有部分的前導(dǎo)肽序列和完整的功能結(jié)構(gòu)域序列，與小鼠和人的氨基酸序列有高度的同源性。但仍未獲得該基因的全長序列。 （2）成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a（+）-SjTGF-β1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出重組融合蛋白，主要以包涵體

15、的形式存在，可被兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體識別，具有免疫反應(yīng)性。 （3）SjTGF-β1基因在日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、成蟲各期均特異轉(zhuǎn)錄。 （4）Sj感染各期小鼠肝臟中.該基因在感染早期的轉(zhuǎn)錄水平較高，蟲體感染21天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平下降，8周時(shí)降至最低，12周時(shí)逐漸上升，感染后期又恢復(fù)至高水平，表明，SjTGF-β1在整個(gè)感染過程中可能參與了致肝纖維化的作用，同時(shí)也以自我保護(hù)的方式參與免疫逃避。 （5）Sj總蛋白中不