pVAX1-SjscFv-IL18對日本血吸蟲病肝纖維化的影響及其機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　血吸蟲病(schistosomiasis)是一種流行廣泛、嚴重危害人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患寄生蟲病，我國是日本血吸蟲?。╯chistosomiasis japonica）流行最嚴重的四個國家之一。日本血吸蟲（Schistosoma japonicum, Sj）致病的主要原因是雌蟲產(chǎn)出的大量蟲卵沉積于肝、腸等組織中，形成蟲卵肉芽腫、組織損傷和繼發(fā)性肝纖維化。肝纖維化的進一步發(fā)展導(dǎo)致肝硬化，患者可因上消化道出血

2、、肝性昏迷等嚴重并發(fā)癥而致死。因此，阻止蟲卵肉芽腫病變的形成，對于控制日本血吸蟲病的進程、防止晚期血吸蟲病的發(fā)生具有重要的意義。
　　目前，臨床上采用單一的吡喹酮治療血吸蟲病仍存在一定缺陷，吡喹酮只能殺滅童蟲和成蟲，而不能阻止肝組織內(nèi)的蟲卵繼續(xù)分泌抗原，蟲卵可溶性抗原(soluble matured egg antigen，SEA)可引起組織內(nèi)蟲卵肉芽腫反應(yīng)，由于血吸蟲病患者發(fā)現(xiàn)時多已轉(zhuǎn)為慢性，肝組織內(nèi)蟲卵已經(jīng)或正在形成蟲卵肉芽腫

3、或肝纖維化，有效殺蟲治療后病人依然有轉(zhuǎn)化為晚期的可能，SEA誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫病理反應(yīng)并不因殺蟲治療而終止。IL-18是目前已知的對血吸蟲病肝纖維化具有治療作用的細胞因子，然而單純使用細胞因子治療需連續(xù)、大劑量的用藥，勢必導(dǎo)致毒副作用的增加以及宿主體內(nèi)細胞因子的嚴重失衡。
　　因此，我們擬利用實驗室前期篩選得到的對日本血吸蟲雌蟲、未成熟蟲卵、成熟蟲卵等多個階段均具有高特異性免疫靶向作用及識別能力的單鏈抗體（Sj single-chai

4、n Fv.antibody，SjscFv），將其與對血吸蟲性肝纖維化具有治療作用的細胞因子IL-18融合表達，產(chǎn)生SjscFv-IL18融合蛋白，借助SjscFv的免疫及靶向作用攜帶IL-18進入蟲卵肉芽腫和肝纖維化形成的局部，特異性提高局部免疫作用及IL-18濃度，誘導(dǎo)日本血吸蟲感染慢性期從Th2型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化為Th1型優(yōu)勢的免疫應(yīng)答，同時能夠極大地降低IL-18對其它正常組織器官的毒副作用，以期達到更好的抗日本血吸蟲性病纖維化的效果

5、。
　　研究目的：
　　構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pVAX1/SjscFv-IL18，轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，使用SEA刺激后的巨噬細胞上清液處理肝星狀細胞(HSCs)，觀察對HSCs激活、增殖和凋亡的影響，并檢測HSCs中與細胞外基質(zhì)(ECM)沉積相關(guān)的基因表達，評估其抗肝纖維化的能力;并在日本血吸蟲病肝纖維化小鼠中研究其對蟲卵肉芽腫及肝纖維化形成的影響及其作用機制。
　　研究方法：
　　1、真核重組質(zhì)粒pVAX1/SjscFv

6、-IL18的構(gòu)建;
　　采用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1/SjscFv-IL18和pVAX1/SjscFv，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，進行大量表達，并通過雙酶切和測序鑒定，使用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)特征。
　　2、pVAX1/SjscFv-IL18對HSCs膠原生成與降解的影響
　　將各組重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，采用SEA刺激巨噬細胞后的上清液處理HSCs，應(yīng)用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測膠原相關(guān)基因mR

7、NA水平、MTT檢測HSCs細胞增殖、流式細胞術(shù)檢測HSCs凋亡。
　　3、pVAX1/SjscFv-IL18對日本血吸蟲病肝纖維化的影響
　　建立日本血吸蟲病肝纖維化小鼠模型，將pVAX1/SjscFv-IL18注入小鼠體內(nèi)，采用HE、Masson染色方法分別檢測肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的大小、肝組織內(nèi)膠原沉積的情況，應(yīng)用ELISA檢測小鼠Th1/Th2型細胞因子、IL-18，免疫組化檢測肝組織中TGFβ1和IL-18，qPCR

8、檢測肝臟中膠原相關(guān)基因mRNA水平。
　　研究結(jié)果：
　　1、PCR、雙酶切及測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒插入序列與目的序列一致，CD-Search證實所構(gòu)建質(zhì)粒表達蛋白中包含目的蛋白所需的兩個Ig超家族和IL-1超家族保守結(jié)構(gòu)域，說明真核重組質(zhì)粒pVAX1/SjscFv-IL18構(gòu)建成功。
　　2、p VAX1/Sjsc Fv-IL18轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，采用SEA刺激該巨噬細胞產(chǎn)生的上清液處理HSCs，與對照組相比，能夠部分降

9、低HSCs中α-SMA的mRNA水平，并抑制HSCs增殖、促進HSCs凋亡，上調(diào)MMPs-1的同時下調(diào)ColⅠ、ColⅢ和TIMP-1的mRNA表達。
　　3、pVAX1/SjscFv-IL18注入日本血吸蟲病肝纖維化小鼠后，能夠降低肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的大小，減少肝組織內(nèi)膠原的沉積，并在體內(nèi)表達大量的IL18，誘導(dǎo)Th1型優(yōu)勢的免疫反應(yīng)，減少肝臟中TGFβ1表達，上調(diào)MMPs-1的同時下調(diào)ColⅠ、ColⅢ和TIMP-1的mRNA

10、表達，且能夠在蟲卵肉芽腫局部提高IL-18的濃度，從而產(chǎn)生更好的抗日本血吸蟲病肝纖維化的作用。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒pVAX1/SjscFv-IL18。
　　2、pVAX1/SjscFv-IL18在體外能夠通過影響巨噬細胞內(nèi)細胞因子的分泌進而抑制HSCs中膠原的生成，促進膠原降解。
　　3、pVAX1/SjscFv-IL18能夠通過SjscFv的免疫靶向作用提高IL-18的生物學(xué)活性，從而抑