發(fā)形霞水母蝦紅素樣金屬蛋白酶家族的克隆、表達(dá)及其功能研究.pdf

1、水母是一類生物總量龐大的海洋浮游動(dòng)物。水母觸手上密布刺絲囊，當(dāng)觸及人體或動(dòng)物體時(shí)，發(fā)射刺絲進(jìn)行襲擊，同時(shí)釋放出毒液。研究表明，水母毒素主要屬蛋白質(zhì)與多肽類，毒性大，活性高。研究水母毒素發(fā)揮多種強(qiáng)效應(yīng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為闡明水母毒素的組成、作用機(jī)制及充分利用其有效成分奠定基礎(chǔ)。
　　 毒素蛋白具有熱不穩(wěn)定性，組分較復(fù)雜等，傳統(tǒng)分離方法在純化水母毒素蛋白方面效率不高。目前國內(nèi)外對(duì)單一水母毒素蛋白的序列報(bào)道較少，對(duì)其組成、結(jié)構(gòu)還沒有全

2、面深入的了解。因此，為全面篩選與水母毒素生物學(xué)活性密切相關(guān)的功能基因，前期我們選擇我國東南近海常見的有毒水母——發(fā)形霞水母（Cyanea capillata），利用SMART技術(shù)構(gòu)建了其觸手組織cDNA文庫。通過大規(guī)模隨機(jī)測(cè)序和同源比較，發(fā)現(xiàn)其中有三條EST序列所編碼的氨基酸序列與蝦紅素樣金屬蛋白酶家族(astacin-likemetalloproteases)高度同源，提示該三條序列所編碼的蛋白均屬蝦紅素樣金屬蛋白酶。
　　

3、金屬蛋白酶類已被證實(shí)存在于蛇類等有毒動(dòng)物的毒液中，作為毒素組分發(fā)揮重要作用。Hyunkyoung Lee等發(fā)現(xiàn)Nemopilema nomurai等四種水母的刺絲囊毒素具有降解明膠、酪蛋白和纖維蛋白的活性，用廣譜金屬蛋白酶抑制劑處理后大部分活性消失，表明它們主要屬于金屬蛋白酶類[1]，首次證明了水母毒素中存在大量金屬蛋白酶。蝦紅素樣金屬蛋白酶是一種典型的鋅依賴內(nèi)肽酶，有很強(qiáng)的蛋白水解活性。研究發(fā)現(xiàn)，蝦紅素樣金屬蛋白酶能降解細(xì)胞外基質(zhì)組分

4、，引起出血等，這與水母毒素的部分生物學(xué)活性相一致。近期也有研究發(fā)現(xiàn)，褐色蜘蛛(genus Loxosceles)毒液中存在一個(gè)蝦紅素樣金屬蛋白酶基因家族，能降解胞外基質(zhì)組分，協(xié)助其他毒素成分?jǐn)U散，可能作為毒素組分發(fā)揮生物學(xué)功能[2]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)，觸手cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的蝦紅素樣金屬蛋白酶家族很可能在水母毒素發(fā)揮毒性效應(yīng)中具有重要作用。對(duì)該基因家族進(jìn)行深入研究，將有助于闡明水母毒素生物學(xué)活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。
　　

5、 本課題以C.capillata觸手cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的三條蝦紅素樣金屬蛋白酶的編碼序列為基礎(chǔ)，分別將其命名為CALP1((C)yanea capillata(a)stacin-(l)ike metallo(p)roteases1)，CALP2和CALP3。利用生物信息學(xué)等方法對(duì)其序列進(jìn)行了全面分析，構(gòu)建CALP原核重組表達(dá)質(zhì)粒，摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件后進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化，進(jìn)一步對(duì)其活性和功能進(jìn)行研究。
　　 一、CA

6、LP基因家族全長(zhǎng)序列的特征分析
　　 我們通過NCBI在線軟件確認(rèn)CALP基因家族三條序列均具有完整的開放閱讀框。進(jìn)一步利用BLAST比對(duì)后獲得了其全長(zhǎng)cDNA序列。分析顯示，CALP1、CALP2和CALP3均包含一個(gè)典型的蝦紅素樣結(jié)構(gòu)域，含有兩個(gè)特征序列:Zn結(jié)合基序HEXXHXXGFXHEXXRXDRD和Met旋轉(zhuǎn)SXMHY，提示它們同屬蝦紅素樣金屬蛋白酶家族。CALP1、CALP2和CALP3分別含有304、313和33

7、3個(gè)氨基酸殘基，分子量約為35 kDa、35 kDa和38 kDa，均屬于堿性蛋白。CALP2和CALP3含有信號(hào)肽，為分泌蛋白;CALP1不含信號(hào)肽，定位于胞質(zhì)。三個(gè)分子均不含跨膜結(jié)構(gòu)域，但有多個(gè)磷酸化、糖基化位點(diǎn)和二硫鍵，富含親水區(qū)域，疏水區(qū)較少。除蝦紅素樣結(jié)構(gòu)域外，CALP1和CALP3在C端還含有兩個(gè)ShK毒素結(jié)構(gòu)域。ShK結(jié)構(gòu)域能阻斷K+通道，調(diào)節(jié)膜電位，通過阻斷鉀通道的K+外流促進(jìn)Ca2+內(nèi)流[3]，引起胞內(nèi)Ca2+超載而損

8、傷細(xì)胞[4-6]。這提示該兩個(gè)分子除蛋白水解作用外，還可能在毒素發(fā)揮毒性效應(yīng)中具有其他方面作用。
　　 二、CALP基因家族的重組克隆與融合蛋白的小量表達(dá)
　　 根據(jù)CALP1、CALP2和CALP3的完整編碼區(qū)（CALP1去除前肽部分，CALP2和CALP3去除前肽和信號(hào)肽部分）序列設(shè)計(jì)引物，利用pET24a原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建了CALP1、CALP2和CALP3完整編碼區(qū)C端帶有6*His標(biāo)簽的重組表達(dá)載體，經(jīng)酶切和DN

9、A測(cè)序鑒定正確。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)表達(dá)菌中，在1 mM IPTG，37℃，250 rpm條件下小量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示，CALP1、CALP2和CALP3分別在33 kDa、26 kDa和32 kDa有目標(biāo)蛋白條帶。進(jìn)一步使用6*His標(biāo)簽抗體對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定，Western Blot結(jié)果顯示，在全菌裂解液中分別可檢測(cè)到單一特異性條帶，分子量分別為33 k

10、Da、26 kDa和32 kDa，與根據(jù)序列預(yù)測(cè)得到的目標(biāo)蛋白分子量大小相一致。
　　 三、CALP融合蛋白的大量表達(dá)、純化及其生物學(xué)功能研究
　　 1、CALP融合蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的摸索與優(yōu)化
　　 為獲得大量且具有生物學(xué)活性的重組融合蛋白，在小量誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步對(duì)CALP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。首先對(duì)蛋白可溶性表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行了摸索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rosetta菌株比BL

11、21(DE3)菌株更有利于CALP融合蛋白的表達(dá)，但CALP1和CALP2的表達(dá)量相對(duì)較低，CALP3則不能可溶表達(dá)。這可能與蝦紅素樣金屬蛋白酶含有較多的二硫鍵和結(jié)構(gòu)修飾位點(diǎn)有關(guān)，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)在大腸桿菌中很難正確折疊。由于可溶性表達(dá)的融合蛋白表達(dá)量不高且易形成包涵體，我們進(jìn)一步對(duì)CALP融合蛋白包涵體表達(dá)的最佳條件進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在各目標(biāo)融合蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件下，大部分蛋白以包涵體的形式存在于表達(dá)菌裂解液的沉淀中。CALP1和C

12、ALP2的包涵體表達(dá)量較高，CALP3表達(dá)量相對(duì)較低。對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌，利用篩選出的最佳溶解力的溶解液進(jìn)行溶解。利用HisTrap HP凝膠親和層析純化重組蛋白.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CALP1、CALP2和CALP3的分子量分別約為33 kDa、26 kDa和32 kDa，與根據(jù)序列預(yù)測(cè)得到的目標(biāo)蛋白分子量大小相一致。進(jìn)一步使用化學(xué)稀釋法和物理透析法對(duì)融合蛋白進(jìn)行了復(fù)性。
　　 2、C.capillata刺絲囊

13、毒素及CALP融合蛋白的蛋白水解活性檢測(cè)
　　 我們選擇明膠、纖連蛋白和纖維蛋白原作為底物，分別檢測(cè)C.capillata刺絲囊毒素、觸手提取物及CALP融合蛋白的蛋白水解活性。明膠降解法的結(jié)果顯示，刺絲囊毒素在95 kD和72 kD之間有一條明顯白色條帶，在170 kD有一條較淡條帶，抑制劑1，10-二氮菲作用后，條帶明顯減弱。表明刺絲囊毒素具有降解明膠的作用。C.capillata刺絲囊毒素對(duì)纖連蛋白、纖維蛋白原也表現(xiàn)出明顯

14、的蛋白水解活性，且蛋白水解作用也可被抑制劑顯著抑制。C.capillata觸手提取物對(duì)明膠、纖連蛋白和纖維蛋白原也具有降解作用，但活性弱于刺絲囊毒素。我們進(jìn)一步檢測(cè)了C.capillata觸手提取物對(duì)貼壁細(xì)胞形態(tài)變化的影響。結(jié)果表明，TE作用于腎小管上皮細(xì)胞1h后，與正常對(duì)照組相比，TE處理組細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯變大，細(xì)胞從培養(yǎng)板底部脫離。表明C.capillata觸手提取物能降解胞外基質(zhì)組分，這也與文獻(xiàn)報(bào)道的水母毒素胞外基質(zhì)降解作用

15、相一致。
　　 我們采用五種復(fù)性方案對(duì)純化的CALP融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，檢測(cè)其蛋白水解活性。結(jié)果顯示，復(fù)性后的CALP融合蛋白的蛋白水解活性較弱。明膠降解檢測(cè)時(shí)，CALP1和CALP3在95 kD和72 kD之間有一條微弱的白色條帶，與NV的蛋白降解條帶位置一致，但活性較弱。CALP2活性不明顯。這可能是由于包涵體復(fù)性條件不佳，或因?yàn)镃ALP含有較多的二硫鍵和結(jié)構(gòu)修飾位點(diǎn)，蛋白空間結(jié)構(gòu)很難正確折疊。我們也擬進(jìn)一步使用畢赤酵母真核表

16、達(dá)系統(tǒng)對(duì)CALP融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，驗(yàn)證其蛋白水解活性和對(duì)胞外基質(zhì)的降解作用，最終闡明CALP家族在水母毒素發(fā)揮毒性效應(yīng)中的功能。
　　 綜上所述，我們通過大規(guī)模測(cè)序和同源分析，從C.capillata觸手cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了蝦紅素樣金屬蛋白酶CALP基因家族。該家族的三個(gè)成員在序列上與蝦紅素樣金屬蛋白酶具有高度同源性，含有保守的蝦紅素樣結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建了pET24a-CALP1、pET24a-CALP2和pET24a-CALP3