DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌細胞系中低表達機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　乳腺癌發(fā)病率居世界女性腫瘤的第一位，嚴重危害女性身心健康。目前全球每年約有120萬婦女患病，50萬婦女死于乳腺癌。近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，并且發(fā)病年齡有所下降。因此乳腺癌的防治成為腫瘤研究的重要課題。DLC-1（Deletedinlivercancer-1）是一抑癌基因，在肝癌及其他惡性腫瘤如乳腺癌等常呈低表達或無表達。DLC-1具有抗腫瘤細胞增殖和轉移的作用。它的失活將會引起生物學過程的改變并導

2、致惡性表型。DLC-1蛋白含有四個重要的結構域：Rho-GAP（RhoGTPaseactivatingproteins）結構域、SAM（sterileαmotif）結構域、START（steroidogenicacuteregulatoryproteinrelatedlipid-transferdomain）結構域和SR(serine-richregion)結構域。DLC-1的主要功能結構域是Rho-GAP結構域，通過調控Rho蛋白的活

3、性抑制細胞增殖和轉移。DLC-1基因失活可使Rho蛋白過度激活，從而向細胞內持續(xù)傳遞生長信號,導致腫瘤的發(fā)生和進展加速。
　　抑癌基因失活的機制主要包括遺傳學改變和表觀遺傳學改變。啟動子區(qū)域的高甲基化是某些抑癌基因失活的原因之一。CpG島的異常甲基化往往早于細胞的惡性增生，基因組的甲基化往往伴隨癌癥的發(fā)生而出現(xiàn)，并隨腫瘤的惡性程度增加而增加，因此對DNA甲基化的檢測可用于腫瘤的診斷和預后評估，也是腫瘤研究的熱點之一。
　　D

4、LC-1基因在乳腺癌中表達下調，因此，探討該基因在乳腺瘤中失活的機制尤為重要?；谀壳耙炎C實的DLC-1啟動子區(qū)存在CpG島的現(xiàn)象，研究抑癌基因DLC-1啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)、及其與乳腺癌的相關性，對于理解乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移機制有一定的幫助。
　　目的:
　　探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌細胞系中低表達的可能的機制，檢測DLC-1啟動子區(qū)CpG島是否存在甲基化現(xiàn)象，研究去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶(5

5、-Aza-CdR)對MCF-7細胞DLC-1mRNA及蛋白表達量的影響，并觀察5-Aza-CdR處理后對腫瘤細胞遷移能力的影響。建立DLC-1過表達MCF-7細胞模型，并應用免疫熒光染色技術檢測DLC-1基因對乳腺癌細胞MCF-7細胞骨架形成的影響。
　　方法:
　　1)提取人乳腺癌細胞MCF-7的基因組DNA，Bisulfite處理后用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測其DLC-1基因啟動子區(qū)甲基化狀況。
　　2)不

6、同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)處理的MCF-7乳腺癌細胞，觀察藥物對細胞形態(tài)的影響，并通過劃痕實驗觀察5-Aza-CdR處理后對腫瘤細胞遷移能力的影響。
　　3)通過Real-TimePCR、RT-PCR、Westernblot技術檢測在不同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)處理的MCF-7乳腺癌細胞中DLC-1的表達情況。
　　4)應用陽離子脂質體將DLC-1/pcDNA3.1/N

7、v5-DESTTM轉染MCF-7細胞，建立DLC-1過表達細胞模型，運用免疫熒光染色法檢測細胞骨架受該基因的影響。
　　結果:
　　1)通過MSP法驗證了在乳腺癌細胞系MCF-7中確實存在DLC-1基因啟動子的甲基化。
　　2)去甲基化藥物5-Aza-CdR處理乳腺癌細胞MCF-7,應用RT-PCR和Real-timePCR、WesternBlot方法檢測DLC-1mRNA及蛋白的表達量，實驗表明應用去甲基化藥物組的細

8、胞比未經藥物處理的MCF-7細胞DLC-1的表達量明顯增加，且10μmol/L劑量組的表達強度最高。
　　3)應用去甲基化藥物5-Aza-CdR處理MCF-7細胞，觀察到去甲基化藥物能使細胞的生長、遷移速度減緩，藥物處理后的細胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞變圓，突起回縮。
　　4)過表達DLC-1基因能夠影響細胞骨架的形成。DLC-1過表達的MCF-7細胞骨架結構經FITC-Phalloidin染色顯示，細胞胞漿中的微絲較野生型

9、MCF-7細胞明顯減少，極性消失，呈粗顆粒狀不連續(xù)分布在細胞周邊，局部收縮聚集成團并形成空泡狀結構,并且發(fā)現(xiàn)細胞變圓變大，突起回縮。
　　結論:
　　1)抑癌基因DLC-1的啟動子區(qū)CpG島甲基化是導致該基因低表達的原因之一。
　　2)5-Aza-CdR能逆轉DLC-1基因甲基化狀態(tài)。
　　3)5-Aza-CdR能使細胞的生長、遷移速度減緩，藥物處理后的細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞變圓，突起回縮。
　　4)恢