RNA干擾抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞S100A4基因表達(dá)的實驗研究.pdf

1、[研究目的和意義]
　　 乳腺癌是女性乳腺最常見的惡性腫瘤,亦是女性最常見的惡性腫瘤之一。我國雖屬乳腺癌的低發(fā)區(qū),但近年乳腺癌的發(fā)病率同樣呈上升趨勢。本課題運(yùn)用RNA干擾技術(shù),以S100A4為目的基因體外合成S100A4-shRNA(short hairpin RNA)模板鏈,并連接載體pGenesil-1.1與S100A4-shRNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,通過S100A4

2、-shRNA沉默S100A4基因表達(dá)后,觀察MCF-7細(xì)胞在增殖、凋亡,以及侵襲力和遷移力方面的變化。本課題可以為乳腺癌的基因治療提供新的著眼點,具有一定的科研意義和臨床實用價值。
　　 [統(tǒng)計方法]
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)均以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA):首先進(jìn)行方差齊性檢驗,若各組間反應(yīng)變量為方差齊性,則組間比較采用LSD法；若方差不

3、齊采用近似方差分析Welch法和Brown-Forsythe法進(jìn)行校正,若方差仍為不齊,則組間比較采用Dunnetts T3法。MTT實驗另采用重復(fù)測量資料方差分析明確分組與時間點之間是否存在交互作用。P<0.05,為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [研究方法和結(jié)果]
　　 第一章 靶向S100A4的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 [目的]合成兩條重組質(zhì)粒做為S100A4-shRNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞,使S100A4

4、-shRNA沉默S100A4基因的表達(dá)。
　　 第二章 RNA干擾抑制MCF-7細(xì)胞S100A4基因表達(dá)的體內(nèi)實驗研究
　　 2.1 免疫組化實驗檢測MCF-7細(xì)胞中S100A4蛋白的表達(dá)
　　 [目的]檢測MCF-7細(xì)胞中S100A4蛋白的表達(dá)情況。
　　 [方法]本實驗分為兩組,即:空白對照組和實驗組。將苔盤蘭染色活力>95％的MCF-7細(xì)胞以1x106/孔種于6孔板中的無菌蓋玻片,使用免疫組化Env

5、ision法,檢測S100A4蛋白在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2.2 MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗
　　 [目的]檢測經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞情況。
　　 2.3 QRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后S100A4基因表達(dá)的變化
　　 [目的]檢測轉(zhuǎn)染48h后,MCF-7細(xì)胞中S100A4基因的表達(dá)情況,并篩選出沉默S100A4表達(dá)效率更高的一條重組質(zhì)粒。
　　 2.4 Western blo

6、t法檢測轉(zhuǎn)染后S100A4蛋白表達(dá)的變化
　　 [目的]檢測轉(zhuǎn)染48h后,MCF-7細(xì)胞中S100A4蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.5 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖的變化
　　 [目的]檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞增殖的變化情況。
　　 2.6 AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率的變化
　　 [目的]檢測轉(zhuǎn)染24h后,MCF-7細(xì)胞凋亡的變化情況。
　　 2.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

7、細(xì)胞株的建立及其形態(tài)觀察
　　 [目的]建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株觀察其形態(tài)學(xué)的變化。
　　 [方法]首先確定G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞的濃度,將苔盤藍(lán)計數(shù)細(xì)胞活力>95％的MCF-7細(xì)胞以1x106/孔種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后分別換成含有0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000ug/ml G418的10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),每隔3天換液,對比觀察正常細(xì)胞和G41

8、8篩選組細(xì)胞的生長情況,取一周70％死亡,二周100％死亡的最低G418濃度為篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞的濃度(該實驗確定G418篩選濃度為500ug/m1)。實驗分為3組即:實驗對照組、陰性對照組、空白對照組,前兩組分別轉(zhuǎn)染實驗用重組質(zhì)粒以及陰性對照質(zhì)粒,將轉(zhuǎn)染24h后的MCF-7細(xì)胞按照1:10傳代。并設(shè)置正常細(xì)胞對照孔2孔。細(xì)胞貼壁后換含有500ug/ml G418的10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液,每隔3天換液,2周后觀察正常細(xì)胞死

9、亡率100％,轉(zhuǎn)染細(xì)胞30％存活。換含有350ug/mlG418的10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液,1周后出現(xiàn)單個細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察將培養(yǎng)板蓋上發(fā)熒光,光學(xué)顯微鏡下為活細(xì)胞的MCF-7細(xì)胞標(biāo)記。消化收集調(diào)整細(xì)胞濃度<=1個/100ul,100ul/孔種96孔板,擴(kuò)大培養(yǎng),2周后成細(xì)胞集落,5周后長至50％。待細(xì)胞長滿后傳至24孔板,逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)至6孔板和25cm2培養(yǎng)瓶。分別命名實驗組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞為MCF-7-S100A4細(xì)胞

10、,陰性對照組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞為MCF-7-HK細(xì)胞。使用免疫組化Envision法觀察MCF-7-S100A4細(xì)胞、MCF-7-HK細(xì)胞以及MCF-7細(xì)胞在形態(tài)、大小等生物學(xué)特性中的區(qū)別。
　　 [結(jié)果]篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞后,通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),MCF-7細(xì)胞和MCF-7-HK細(xì)胞同樣呈不規(guī)則形狀、大小不一、核大而深染、呈圓形或橢圓形,細(xì)胞極性消失、排列紊亂；MCF-7-S100A4細(xì)胞在大小、形態(tài)以及生長方式上與以上細(xì)胞無明

11、顯差別。
　　 2.8 劃痕實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞的遷移力
　　 [目的]檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞遷移力的變化。
　　 [方法]運(yùn)用劃痕實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞遷移力的變化,實驗分為3組,即:實驗組(MCF-7-S100A4細(xì)胞組)、陰性對照組(MCF-7-HK細(xì)胞組)以及空白對照組,取處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞以1x106個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)。在單層細(xì)胞表面用100μl移液器槍頭垂直劃痕,PBS液輕洗2次,在倒置顯微

12、鏡下觀察0、
　　 6、24和48h后劃痕中細(xì)胞遷移情況,并拍照。
　　 [結(jié)果]體外劃痕實驗結(jié)果顯示,實驗組中MCF-7-S100A4細(xì)胞的移動速度明顯慢于,空白對照組中MCF-7細(xì)胞以及陰性對照組中MCF-7-HK細(xì)胞；接種后48h,MCF-7細(xì)胞以及MCF-7-HK細(xì)胞劃痕已經(jīng)基本長滿,而MCF-7-S100A4細(xì)胞劃痕尚未長滿。
　　 2.9 Transwell小室法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞侵襲力
　　

13、 [目的]檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞侵襲力的變化。
　　 [方法]首先實驗分為3組,即:實驗組(MCF-7-S100A4細(xì)胞組)、陰性對照組(MCF-7-HK細(xì)胞組)以及空白對照組,通過Transwell小室法對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞侵襲力的變化進(jìn)行檢測。
　　 第三章 RNA干擾抑制MCF-7細(xì)胞S100A4基因表達(dá)的體內(nèi)實驗研究
　　 3.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤實驗
　　 [目的]通過將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞細(xì)

14、胞接種于裸鼠背部,檢測裸鼠背部移植瘤成瘤情況。
　　 [方法]本實驗分組分為3組,即:陰性對照組(MCF-7-HK細(xì)胞組)、實驗組(MCF-7-S100A4細(xì)胞組)、空白對照組,每組裸鼠10只。取上述各組細(xì)胞分別消化制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個/mL,每只裸鼠頸背部皮下注射0.4ml。種植腫瘤細(xì)胞后,每天觀察裸鼠飲食、精神及活動狀況,每隔2d測定腫瘤大小,并測量腫瘤最長徑(a)及其垂直方向最大橫徑(b),按公式V(

15、mm3)=a×b2/2計算腫瘤體積,并繪制移植瘤的生長曲線圖并計算抑瘤率。觀察35d后,脫頸處死裸鼠,測量各組裸鼠移植瘤的質(zhì)量,對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 3.2 QRT-PCR法檢測裸鼠背部移植瘤中S100A4基因的表達(dá)
　　 [目的]檢測各組裸鼠背部移植瘤中S100A4基因的表達(dá)。
　　 [方法]本實驗分組同上,每組隨意選取4只成瘤裸鼠,取背部移植瘤組織進(jìn)行實驗,另取裸鼠背部正常組織作為對照。通過QRT-PC

16、R的方法,采用Sybrgreen染料法,以GAPDH為內(nèi)參基因,對于S100A4基因在各組裸鼠背部移植瘤組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測。
　　 3.3 Westernblot法檢測裸鼠背部移植瘤中S100A4蛋白的表達(dá)
　　 [目的]檢測各組裸鼠背部移植瘤中S100A4蛋白的表達(dá)。
　　 [方法]實驗分組同上,每組隨意選取4只成瘤裸鼠,取背部移植瘤組織進(jìn)行實驗,另取裸鼠背部正常組織作為對照。通過Western blot法

17、檢測各組裸鼠背部移植瘤中S100A4蛋白的表達(dá)。
　　 [研究結(jié)論]
　　 本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為研究模型,以構(gòu)建攜帶針對S100A4的特異干涉序列的S100A4-shRNA作為進(jìn)行RNA干涉的工具,沉默S100A4基因的表達(dá)。根據(jù)實驗結(jié)果,本研究闡明了以下幾點:
　　 1)通過S100A4-shRNA沉默S100A4,能有效抑制MCF-7細(xì)胞中S100A4的表達(dá)。
　　 2)通過S100A4-

18、shRNA沉默S100A4,能有效抑制MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡的發(fā)生。
　　 3)通過S100A4-shRNA沉默s100A4,能有效抑制MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲力。
　　 4)通過S100A4-shRNA沉默S100A4,能有效抑制MCF-7細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力。
　　 鑒于以上結(jié)果,得出以下結(jié)論,我們構(gòu)建的攜帶S100A4特異干涉序列的S100A4-shRNA能有效沉默S100A4基因,抑制MCF-7