RNAi干擾人CD4+CD25-T細(xì)胞MLL1基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討siRNA對體外人CD4+CD25-T細(xì)胞中MLL1基因表達(dá)的抑制效果，研究在MLL1基因表達(dá)減少的情況下，iTreg的誘導(dǎo)是否受到影響，為治療與Treg失衡相關(guān)的免疫疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：使用免疫磁珠分選方法從正常健康人外周血中分離出CD4+CD25-T細(xì)胞（純度＞85％）。針對H3K4甲基化起重要作用的MLL1基因SET區(qū)設(shè)計(jì)并合成了不同的siRNAs，分別為帶綠色熒光的siRNA(siRNA-FAM)、

2、三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(siRNA-1，siRNA-2，siRNA-3)與一個(gè)陰性對照組(siRNA-NC)。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染分選后培養(yǎng)24h的人CD4+CD25-T細(xì)胞。先轉(zhuǎn)染siRNA-FAM，于轉(zhuǎn)染后的6h，用熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率，尋找最佳的轉(zhuǎn)染條件。然后按照上述轉(zhuǎn)染條件來轉(zhuǎn)染siRNA-1，siRNA-2,siRNA-3,siRNA-NC。于轉(zhuǎn)染后的48h，每組取2×106個(gè)細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用聚合

3、酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增該片段，用瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增后的DNA。在MLL1基因表達(dá)受到抑制的情況下，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測TGF-β1誘導(dǎo)72hiTreg的比例。
　　 結(jié)果：當(dāng)siRNA為100pmol，脂質(zhì)體為5μl時(shí)，siRNA的轉(zhuǎn)染效率達(dá)最高為（50.8±0.61）％。該實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組siRNA-2對MLL1基因mRNA較對照組有明顯的消弱作用(F=5.82,P＜0.05)。在MLL1基因表達(dá)削弱的情況下，TGF-β1誘導(dǎo)72h