沉默BubR1對(duì)人HBV陽(yáng)性肝癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)BubR1在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，觀察沉默BubR1后對(duì)人HBV（Hepatitis B virus）相關(guān)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期的影響，驗(yàn)證BubR1和HBx(HBV X protein)蛋白的相互關(guān)系以及BubR1影響肝癌細(xì)胞活性可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.運(yùn)用 RT-PCR及 Western Blot技術(shù)檢測(cè)人 HBV陽(yáng)性肝癌細(xì)胞株（HepG2.2.15）及HBV陰性肝癌細(xì)胞株（HepG2、S

2、MMC7721和Huh7）中BubR1的表達(dá)，并篩選出BubR1高表達(dá)細(xì)胞株。
　　2.設(shè)計(jì)并合成3對(duì)針對(duì)BubR1的特異性小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)共設(shè)Nomal組、Control-siRNA組及BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3各轉(zhuǎn)染組
　　3.運(yùn)用RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中Bu

3、bR1在mRNA和蛋白水平的變化，篩選出沉默效果最好的BubR1-siRNA序列。
　　4.通過(guò)MTT比色法檢測(cè)沉默BubR1后細(xì)胞增殖能力的改變，運(yùn)用Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期的改變。
　　5.通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)沉默BubR1后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MAPKs各信號(hào)通路（ERK1/2、JNK、p38MAPK）節(jié)點(diǎn)分子、NF-κB信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Caspase-

4、3）表達(dá)量改變，以明確BubR1影響肝癌細(xì)胞活性可能的機(jī)制。
　　6.通過(guò)免疫共沉淀及雙色免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)分別檢測(cè) HBx蛋白與BubR1蛋白在HBV陽(yáng)性肝癌細(xì)胞中的相互作用關(guān)系及在細(xì)胞中的定位。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR及Western Blot結(jié)果均顯示，在四種肝癌細(xì)胞系中，BubR1基因均呈陽(yáng)性表達(dá)，且在HepG2.2.15細(xì)胞中BubR1 mRNA和蛋白水平皆呈相對(duì)最高表達(dá)。
　　2.

5、分別用3對(duì)特異性BubR1-siRNAs轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，24h和48h后分別提取mRNA和蛋白，發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)染組（BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3組）的mRNA和蛋白表達(dá)水平相比較Nomal組、Control-siRNA組下降，且BubR1-3組抑制效果最明顯。
　　3. MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖及平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BubR-3轉(zhuǎn)染組HepG2.2.15細(xì)胞增殖能力較Nomal組、Control-siRN

6、A組明顯受到抑制。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，BubR1-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率增高，G1期細(xì)胞顯著減少，S期細(xì)胞明顯增加，即細(xì)胞阻滯于S期。
　　5. Western Blot檢測(cè)顯示，沉默BubR1可顯著抑制p-ERK蛋白和p-NF-κB蛋白的表達(dá)，而p-P38、p-JNK1/2以及各通路非磷酸化蛋白的表達(dá)較Nomal組、Control-siRNA組相比無(wú)明顯變化。
　　6. Western Blot檢測(cè)顯示，沉默

7、BubR1，BubR1-3組中Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)水平較Nomal組、Control-siRNA組增高。
　　6.免疫共沉淀技術(shù)顯示，瓊脂糖珠、BubR1及HBx能夠共同形成瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，HBx與BubR1能直接或間接地結(jié)合。雙色免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)顯示，BubR1及HBx在HepG2.2.15細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，且BubR1與HBx在HepG2.2.15細(xì)胞核內(nèi)共定位。
　　結(jié)論：